Нейротоксические эффекты тиомерсала у крыс
Нейротоксические эффекты тиомерсала у крыс
Аннотация
Тиомерсал – орто-этилртутьтиосалицилат натрия (CAS 54-64-8), одно из наиболее известных и исследуемых ртутьорганических соединений (РОС), он используется в качестве консерванта в вакцинах и некоторых косметических средствах, является метаболическим предшественником диэтилртути, самого известного токсического соединения ртути. Полагают, что тиомерсал может провоцировать некоторые нейродегенеративные нарушения, в частности аутизм.
Целью исследования явилось изучение тиомерсала как нейротоксического агента на поведенческие реакции крыс, его влияние на репродуктивные процессы на фоне данных о распределении ртути в крови и мозге животных.
Материалы и методы. Работа выполнена на белых беспородных крысах самках и рожденных ими крысятах. Тиомерсал в дозе 0,05 LD50 поступал в организм крыс с питьевой водой в предгестационный период. Поведение крыс и крысят изучено в тесте «открытое поле». Концентрацию ртути в крови и тканях исследовали спектрометрическим методом. Были использованы приемы статистической обработки данных «Statistica 10.0», критерии Manna-Whitney и Shapiro-Wilka, а также методы непараметрической статистики.
Результаты. Установлено, что интоксикация крыс самок тиомерсалом изменяет поведенческие реакции животных, наблюдается умеренный активирующий эффект на поведение животных, проявляющийся в повышении общей двигательной активности. Изменения поведенческой активности крысят характеризуются теми же тенденциями, что у их матерей, за исключением того, что эти изменения выражены ярче и отличаются увеличением латентного периода. Применение тиомерсала снижает жизнеспособность потомства, приводит к накоплению ртути в тканях мозга крыс и крысят. Гестация затравленных тиомерсалом крыс сопровождается уменьшением содержания ртути в их крови.
Заключение. Энтеральная интоксикация крыс тиомерсалом в суточной дозе 0,05 LD50 в течение 25 дней изменяет поведенческие реакции и структуру поведения крыс и рожденных ими крысят, приводит к значительному накоплению ртути в крови и мозге животных. У затравленных животных гестация уменьшает содержание ртути в крови по сравнению с небеременными животными. Не влияя на плодовитость крыс, тиомерсал снижает выживаемость новорожденных.
1. Введение
Одной из актуальных и сложных задач экспериментальной токсикологии является изучение неврологических нарушений здоровья, возникающее при воздействии экотоксикантов . В этом отношении интерес представляют трансгенерационные эффекты некоторых известных ксенобиотиков, к которым можно отнести, в частности, ртутно-органические соединения (РОС) , . Впервые обстоятельно об этой проблеме стали говорить после известного инцидента в Ираке (1971 г.), когда у женщин, потреблявших зерно, протравленное ртуть-содержащими пестицидами и не имевших клинических признаков отравления, рождались нездоровые дети . Известно, что РОС хорошо всасываются в кишечнике и преодолевают гемато-энцефалический и плацентарный барьеры.
Наряду с хорошо известными нейротоксическими эффектами ртути и ее влиянием на работу печени, почек большее внимание в исследованиях уделяют повышенному риску репродуктивных потерь.
Пожалуй, одним из наиболее упоминаемых в научной литературе и известным в медицинской практике РОС является тиомерсал (Тимеросал, Мертиолят, Мерторган, Мерзонин). По радикально-функциональной химической номенклатуре это орто-этилртутьтиосалицилат натрия, с брутто-формулой – C9H9HgNaO2S (CAS 54-64-8). LD50 тиомерсала равно 75 мг/кг . Это достаточно широко применяемый в мировой практике противобактериальный и противогрибковый компонент прививочных материалов . В США он используется как консервант более чем в 30-ти вакцинах в концентрациях от 0,0003% до 0,01%. В Российской Федерации тиомерсал входит в состав не менее 8-ми вакцин. Согласно Национальному календарю прививок, ребенку до годовалого возраста с прививками 15 раз могут внести в организм тиомерсал. Помимо вакцин, тиомерсал входит как консервант в некоторые препараты для наружного применения – до 0,01%.
Повышенный интерес к тиомерсалу возник в связи с появившимися подозрениями на то, что «прививочные» дозы этого РОС провоцируют тонкие психические нарушения у детей, в частности аутизм , . Связь аутизма с тиомерсалом является дискуссионной темой большого количества исследований и, прежде всего, из-за невозможности установить определенную связь «доза-эффект» тиомерсала для детей .
Экспериментальные исследования с использованием этого РОС в дозах близких к тем, что, например, получают регулярные потребители морской или пресноводной рыбы могли бы в какой-то мере пролить свет на проблему. Исследования этого РОС могло бы помочь пониманию механизмов действия и точек приложения токсиканта, обозначить направления дальнейших исследований , . В этом отношении интересно оценить действие тиомерсала как источника органической ртути – этилртути, которая образуется в результате распада тиомерсала в организме.
Целью настоящего исследования явилось изучение влияния тиомерсала на поведенческие реакции крыс и крысят, на репродуктивные процессы на фоне данных о распределении ртути в крови и мозге этих животных.
2. Методика исследования
Самки беспородных белых крыс были получены из Федерального государственного унитарного предприятия «Питомник лабораторных животных «Рапполово» Национального исследовательского центра «Курчатовский институт». Содержание крыс осуществлялось в соответствии с требованиями ГОСТ 33044-2014 от 01.08.2015 «Принципы надлежащей лабораторной практики».
В период половозрелости (с 25-го после рождения дня) и до зачатия с питьевой водой крысы получали тиомерсал. Расчеты и фактическое потребление воды показали, что суточная доза по веществу составила 0,05 LD50, т.е. по 3,75 мг/кг или 1,86 мг/кг ртути. С учетом переноса доз это соответствовало количеству ртути, например, потребляемой жителями западного побережья Африки, в рационе которых рыба составляет значительную долю . Выбор дозы был продиктован также желанием сравнить токсические эффекты других соединений ртути в этой же дозе .
К интактным самкам подсаживали интактных самцов в соотношении 2:1 на протяжении 10 дней до момента наступления беременности. По наличию сперматозоидов в вагинальном мазке определяли наступление беременности.
Опытные животные, т.е. получавшие тиомерсал, были разделены на две группы – беременные – группа I и небеременные – группа II. Контрольные животные, т.е. не получавшие тиомерсал, также были представлены двумя группами – беременными – группа III и небеременными крысами – группа IV (см. таблицу 1).
Таблица 1 - Обозначение групп экспериментальных животных
Физиологическое состояние крыс | Условия интоксикации | |
Тиомерсал | Питьевая вода | |
Беременные | I группа (n=15) | III группа (n=15) |
Небеременные | II группа (n=12) | IV группа (n=10) |
В каждый из трех равных по продолжительности периодов гестации у крыс-самок и синхронно у контрольных животных производили отбор биологического материала (кровь, ткани головного мозга) для анализа на содержание ртути. Такой подход к забору материала позволил сравнивать данные для одного и того же периода развития крыс. Анализ тканей мозга крысят на содержание ртути производили на момент прекращения грудного вскармливания.
Поведенческую активность животных исследовали в тесте «открытое поле» . Статистическая обработка проводилась с использованием пакета программ «Statistica 10.0» по t-критерию Стьюдента в случае нормального распределения признака и критерия Manna-Whitney при неравномерном распределении. Нормальность оценивалась по критерию Shapiro-Wilka. За статистически значимые изменения был взят уровень достоверности р≤0,05. Обобщенную оценку влияния тиомерсала на поведенческие реакции животных в тесте «открытое поле» также осуществляли на основе приемов непараметрической статистики , .
Содержание ртути в биоматериалах определяли на отечественных анализаторах РА-915+ и Юлия-5 методами непламенной спектрометрии с применением стандарта ГСО 9653-2010 .
3. Результаты исследования
Результаты анализа поведенческой активности крыс самок (таблица 2) свидетельствуют об отсутствии достоверных изменений отдельных регистрируемых показателей под влиянием тиомерсала.
В то же время, анализируя ситуацию в целом, методом непраметрической статистики, можно говорить, что тиомерсал оказывает умеренный активирующий эффект на поведение животных, проявляющийся в повышении общей двигательной активности, увеличении пройденной дистанции, скорости передвижения, уменьшении латентного периода. Изменения в поведении крысят по тесту «открытое поле» характеризуются теми же тенденциями, что у их матерей, за исключением того, что эти изменения выражены ярче и отличаются увеличением латентного периода. Считается, что изменения поведенческой активности животных обусловлены повреждающим действием этилртути, а в конечном итоге собственно ртути, которая образуется в результате метаболизма тиомерсала, ее действием на ганглии дорзальных корешков и нейроны мозжечка .
Таблица 2 - Изменение структуры поведения по тесту «открытое поле» белых беспородных крыс, подвергшихся интоксикации ацетатом ртути, и крысят
Оцениваемые показатели | Экспериментальные группы | |||
Матери | Дети | |||
Контроль | Опыт | Контроль | Опыт | |
Общая двигательная активность (у.е.) | 211,20 ± 44,56 | 219,70 ± 27,70 | 196,20 ± 21,76 | 226,44 ± 24,3 |
Локомоторная активность (у.е.) | 108,00 ± 33,77 | 117,90 ± 20,65 | 73,30 ± 11,90 | 94,00 ± 11,90 |
Стереотипия (у.е.) | 103,20 ± 12,4 | 101,80 ± 8,06 | 122,90 ± 10,48 | 132,63 ± 13,0 |
Латентный период, с. | 11,82 ± 5,31 | 9,04 ± 2,26 | 4,83 ± 0,79* | 13,83 ± 2,65* |
Пройденная дистанция, м. | 12,16 ± 4,12 | 14,09 ± 2,57 | 7,67 ± 1,29 | 9,97 ± 1,30 |
Средняя скорость передвижения, см/мин. | 4,06 ± 1,38 | 4,69 ± 0,86 | 2,56 ± 0,43 | 3,32 ± 0,43 |
Время замирания, с. | 246,30 ± 13,0 | 233,55 ± 11,65 | 272,04 ± 4,65 | 272,25 ± 2,98 |
Время активное, с. | 53,85 ± 12,6 | 66,89 ± 11,64 | 35,28 ± 7,80 | 28,03 ± 2,87 |
Количество стоек | 5,20 ± 1,93 | 3,90 ± 0,60 | 13,80 ± 2,35 | 9,88 ± 1,84 |
Количество болюсов | 0,80 ± 0,58 | 1,20 ± 0,89 | 1,70 ± 0,58 | 1,70 ± 0,43 |
Примечание: *,^ — отличие достоверно от контроля по t-критерию Стьюдента, при р≤0,05; M ± m, n=10
Динамика изменения содержания ртути в крови беременных (группа I) и небеременных (группа II) крыс представлена на рисунке 1. Прежде всего, обращают на себя внимание высокие значения содержания ртути в крови затравленных тиомерсалом крыс, порядка 103 мкг/дм3. Пероральная затравка неорганическими ацетатом и нитратом ртути дает гораздо меньшие значения концентраций ртути в крови крыс порядка 102 мкг/дм3 . Это обстоятельство еще раз подтверждает известный факт, что органические соединения ртути из-за хорошей всасываемости в ЖКТ более опасны, чем неорганические соединения. Следствием этого является известное предупреждение об ограничении потребления хищных рыб, содержащих, как известно, достаточно высокие концентрации РОС .
Рисунок 1 - Изменение содержания ртути в крови крыс в течение беременности
Из данных таблицы 3 следует, что в тканях мозга крысят наблюдается почти на порядок больше ртути, чем в тканях мозга контрольных животных (группа II). Мы полагаем, что у беременных крыс определенная доля ртути из материнской крови элиминируется в ткани развивающегося плода.
Следует отметить, что содержание ртути в тканях мозга крыс в последнем триместре достоверно выше, чем в первом триместре, что может свидетельствовать о перераспределении ртути между органами и тканями.
Таблица 3 - Содержание ртути в тканях головного мозга крыс и крысят
Группы животных | Триместр | Тиомерсал, мкг/кг вл.в. | Контроль (без тиомерсала), мкг/кг вл.в. |
Беременные крысы | I | 202±7* (n=4) | 6,3±0,18^ (n=5) |
III | 265±7* (n=4) | 4,4±0,13^ (n=5) | |
Небеременные крысы | 2,7±0,10^ (n=10) | ||
Крысята | 53,4±1,9 (n=10) | 2,2±0,03 (n=8) | |
Примечание: *,^ – отличия статистически значимы, при р≤0,05
Могут возникнуть вопросы о концентрации ртути в головном мозге контрольных крыс и влиянии на нее гестации. Дело в том, что ртуть присутствует практически везде в тех или иных количествах, в частности, как показывают измерения, в корме для крыс (рецепта № ПК-120-2сч_333).
Интоксикация крыс тиомерсалом, не влияя на плодовитость, снижает выживаемость новорожденных. Почти 10% новорожденных крысят, полученных от матерей, подвергшихся интоксикации ртутью, умирали к концу месяца наблюдения. В контрольной группе все потомство оставалось живым за этот период.
Полученные экспериментальные данные коррелируют с результатами клинико-эпидемиологического обследования беременных женщин и детей ими рожденных в центральном районе Санкт-Петербурга и подтверждают вывод, что следует опасаться энтерального поступления органических соединений ртути в организм молодых и беременных женщин . Такое поступление ртути может приводить к не столь грубым изменениям поведенческих характеристик как у крысят, но к более тонким и не менее существенным для личности нарушениям психики. В этом свете было бы полезно контролировать содержании ртути в крови молодых женщин перед беременностью, в ходе ее и в грудном молоке.
4. Заключение
Обобщая полученные данные, можно определенно сказать, что энтеральная интоксикация крыс тиомерсалом в суточной дозе 0,05 LD50 в течение 25 дней отражается на поведенческих реакциях крыс и изменяет структуру поведения ими рожденных крысят, приводит к значительному накоплению ртути в крови и мозге животных. Состояние беременности уменьшает содержание ртути в крови по сравнению с небеременными животными.
Не влияя на плодовитость крыс, тиомерсал снижает выживаемость новорожденных.