Влияние ацетата ртути на репродуктивную функцию крыс
Влияние ацетата ртути на репродуктивную функцию крыс
Аннотация
Введение. Одно из актуальных направлений исследований токсического действия персистентного приоритетного неорганического экотоксиканта ртути на организм – влияние этого токсиканта на репродуктивную сферу. Эти исследования приобретают важное теоретическое и практическое значение в условиях значительного ртутного загрязнения окружающей среды этим металлом и его соединениями в связи с его влиянием на состояние здоровья детей.
Цель исследования. Изучение влияния предгестационного алиментарного поступления ацетата ртути на репродуктивные процессы у крыс, в частности на поведенческие реакции крыс и крысят первого поколения.
Материал и методы. Объектом исследования явились белые беспородные крысы самки, которым перорально с питьевой водой в предгестационный период вводили ацетат ртути в суточной дозе 0,05LD50, и рожденные ими крысята. Исследовали рождаемость и влияние токсиканта на поведенческие реакции в тесте «открытое поле» крыс и крысят. Содержание ртути в крови и тканях мозга определяли спектрометрически на отечественных анализаторах ртути.
Результаты. Интоксикация ацетатом ртути в два раза снижает рождаемость. Структура поведения опытных животных в целом характеризуется изменением общей двигательной активности, снижением ориентировочно-исследовательской деятельности и усилением эмоционального напряжения. Гестация влияет на распределение ртути в тканях мозга и крови животных, динамика изменения содержания ртути в крови беременных крыс резко отличается от таковой небеременных крыс.
1. Введение
Ртуть является персистентным приоритетным неорганическим экотоксикантом. Этому металлу и его соединениям инкриминируют целый ряд специфических токсических эффектов – нейротропное действие, нефротоксический эффект, кардиотропное действие, в том числе токсическое действие на репродуктивные процессы. Работы, опубликованные в последние годы, свидетельствуют о значительной научной и практической значимости исследований, связанных с действием низких доз ртути на репродуктивную сферу , , . Интерес к подобному действию этого металла усиливается тем, что при отсутствии токсического действия ртути на материнский организм, у потомства наблюдаются ярко выраженные нарушения в различных сферах жизнедеятельности .
Последние годы все чаще также обсуждается относительно новое направление в исследовании репродуктивной сферы – эпигенетика, связанное в частности с действием токсичных металлов (ТМ) , . Эпигенетическим изменениям, индуцируемым ртутью, некоторые исследователи инкриминируют проявление ряда нейродегенеративных заболеваний – болезни Альцгеймера, болезни Паркинсона, аутизма, синдрома дефицита внимания/гиперактивности и других аномалий , , . Несмотря на то, что уже известны некоторые механизмы эпигенетической токсичности ртути, сложность предмета изучения и противоречивые данные стимулируют новые исследования в этой области , .
Редкие клинические данные об отравлениях ртутью не дают представления о глубине и многообразии эффектов подобного воздействия на репродукцию. В немалой мере пополнить подобного рода информацию могли бы экспериментальные исследования, например, по алиментарной затравке крыс самок соединениями ртути. В качестве одного из таких соединений представляется интересным ацетат ртути, обладающий свойствами, как неорганических, так и органических соединений. При хорошей растворимости и ионизации в водной среде, ацетат ртути обладает небольшой алифатической группой, что сближает это вещество с органическими соединениями этого металла наиболее частыми источниками отравлений.
Широкое использование ртути в различных сферах хозяйственной деятельности, рост загрязнения окружающей среды ртутью в результате естественных выбросов и техногенных инцидентов, и, как результат, усиление этого негативного экологического фактора на человеческий организм, делают обсуждаемую проблему актуальной , , , .
Целью исследования стало изучение влияния предгестационного алиментарного поступления ацетата ртути на репродуктивные процессы у крыс, в частности на поведенческие реакции крыс и крысят первого поколения.
2. Методы и принципы исследования
В экспериментах были задействованы половозрелые крысы самки (таблица 1), и рожденные ими крысята. Самки беспородных белых крыс в период половозрелости (с 25-го дня после рождения) и до зачатия с питьевой водой получали ацетат ртути. Расчеты по фактическому потреблению воды показали, что суточная доза по веществу составила 0,05LD50, т.е. 2,04 мг/кг или 1,28 мг/кг по ртути. Это количество ртути соответствует, с учетом коэффициента переноса доз, рекомендациям ВОЗ по суточному потреблению ртути в виде морских морепродуктов .
Таблица 1 - Обозначение групп экспериментальных животных
Физиологическое состояние крыс | Условия интоксикации | |
Ацетат ртути | Питьевая вода | |
Беременные | I группа* | III группа* |
Небеременные | II группа* | IV группа* |
Примечание: *n=10
К интактным самкам подсаживали самцов в соотношении 2:1 на протяжении 10 дней до момента наступления беременности. По наличию сперматозоидов в вагинальном мазке определяли гестацию. Такой подход позволил синхронизовать сроки забора материала и сравнивать данные для одного и того же периода развития крыс. С периодичностью 3–4 дня у крыс от зачатия до рождения потомства производили отбор крови, а постмортально ткани мозга для анализа на содержание ртути. Анализ тканей мозга крысят на содержание ртути и исследование их поведенческой активности производили на момент прекращения грудного вскармливания. Содержание ртути в биоматериале определяли методом непламенной спектрометрии на отечественных анализаторах ртути РА-915+ и Юлия-5 с использованием стандартного образца ГСО 9653-2010 .
Поведенческую активность животных исследовали в тесте «открытое поле». Статистическая обработка проводилась с использованием пакета программ «Statistica 10.0» по t-критерию Стьюдента в случае нормального распределения признака и критерия Manna-Whitney при ненормальном распределении. Нормальность оценивалась по критерию Shapiro-Wilka. Для оценки статистически значимых изменений был взят уровень достоверности р≤0,05 (M ± m). Сравнительную оценку влияния ацетата ртути на поведенческие реакции крыс и крысят в тесте «открытое поле» осуществляли на основе приемов непараметрической статистики .
Животных содержали и обращались с ними в соответствии с требованиями ГОСТ 3044-2014 от 01.08.2015 г. – «Принципы надлежащей лабораторной практики». Исследования соответствовали принципам гуманности, изложенным в Директиве 2010/63/ЕU Европейского парламента и Совета Европейского Союза по охране животных, используемых в научных целях. Работа контролировалась комиссией по биоэтике ФГБУ НКЦТ им. С.Н. Голикова ФМБА России.
3. Результаты
Применение ацетата ртути отразилось на основных репродуктивных показателях – плодовитости крыс и выживаемости потомства. У контрольных крыс (группа III) в помете было в среднем 7±2 крысят, а в группе I в два раза меньше – 3±1; отличия достоверны, р=0,006. В контрольной группе (группа III) все крысята благополучно доживали до 30-го дня наблюдения, тогда как в опытной группе смертность за этот период составила 46,6%. У крысят экспериментальной группы (группа I) отмечали атаксию, тремор, парез задних конечностей, спастическое дыхание.
В свете высокой чувствительности развивающегося плода к разного рода токсикантам и ртути в частности, можно предположить, что это выразится в явлениях репродуктивной токсичности в части нарушения поведенческих реакций новорожденных . Показатели поведенческой активности взрослых крыс до беременности и крысят по результатам теста «открытое поле» представлены в таблице 2. Анализ этих данных выявил отрицательное воздействие ацетата ртути на поведение потомства, полученного от матерей, подвергавшихся интоксикации этим соединением ртути. Изменения характеризуются статистически значимым подавлением двигательной (показатель общей двигательной активности, пройденная дистанция и средняя скорость) и исследовательской активности (показатели количества стоек и их продолжительности).
Несмотря на то, что данные теста для контрольных животных материнской и детской групп по абсолютным величинам отличаются, структура поведения опытных животных в целом характеризуется изменением общей двигательной активности, снижением ориентировочно-исследовательской деятельности и усилением эмоционального напряжения.
Анализ данных таблицы 2 с помощью непараметрических критериев статистики свидетельствует (р≤0,05) об одинаковой направленности воздействия ацетата ртути на поведенческие реакции крыс и крысят . Ацетат ртути вызывает схожие изменения в поведенческих реакциях крыс и крысят, правда, у крысят они в среднем более выражены, чем у их матерей. Эти обстоятельства дают основание думать, что в том и другом случае токсическому действию подвергнуты одни те же структуры и механизмы функционирования нервной системы крыс и крысят.
Таблица 2 - Структура поведения белых беспородных крыс по тесту «открытое поле», подвергшихся интоксикации ацетатом ртути и крысят
Оцениваемые показатели | Экспериментальные группы | |||
Крысы самки | Крысята | |||
Контроль (группа IV) | Опыт (группа II) | Контроль | Опыт | |
1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
Общая двигательная активность, число актов | 211,20 ± 44,56 | 164,60 ± 20,01 | 196,20 ± 21,76 | 134,10 ± 17,60* |
Горизонтальная активность, число актов | 108,00 ± 33,77 | 80,50 ± 11,64 | 73,30 ± 11,90 | 49,00 ± 7,78 |
Стереотипные движения, число актов | 103,20 ± 12,36 | 83,80 ± 9,69 | 122,90 ± 10,48 | 85,10 ± 11,10* |
Латентный период (с) | 11,82 ± 5,31 | 11,38 ± 2,59 | 4,83 ± 0,79 | 7,32 ± 22,01 |
Пройденная Дистанция (м) | 12,16 ± 4,12 | 9,58 ± 1,58 | 7,67 ± 1,29 | 5,17 ± 0,87 |
Средняя скорость передвижения (см/мин) | 4,06 ± 1,38 | 3,19 ± 0,53 | 2,56 ± 0,43 | 1,72 ± 0,29 |
Время замирания (с) | 246,30 ± 12,99 | 245,02 ± 9,34 | 272,04 ± 4,65 | 277,49 ± 4,09 |
Время активное (с) | 53,85 ± 12,59 | 55,36 ± 9,29 | 35,28 ± 7,80 | 22,99 ± 4,03 |
Количество стоек | 5,20 ± 1,93 | 2,80 ± 0,44 | 13,80 ± 2,35 | 4,30 ± 1,45* |
Количество болюсов | 0,80 ± 0,58 | 2,70 ± 0,76 | 1,70 ± 0,58 | 1,70 ± 0,50 |
Примечание: M ± m; n=10; *отличие достоверно от контроля по t-критерию Стьюдента, при р≤0,05
Пониманию изменений в репродуктивной сфере животных под действием ртути помогают данные о содержании ртути в организме крыс и крысят. На рисунке 1 представлены данные по изменению содержания ртути в крови I и II групп крыс в течение беременности.
Рисунок 1 - Изменение содержания ртути в крови беременных и небеременных крыс
Примечание: группы I и II
Полученные экспериментальные данные перекликаются с данными обследования женщин в ходе беременности будущих матерей и новорожденных из Центрального района Санкт-Петербурга на содержание ртутив в их крови . В этой работе показано увеличение содержания ртути в крови в течение гестационного процесса и высказано предположение, что содержание ртути увеличивается в крови беременной в результате ее мобилизации из органов и тканей вместе с пластическим материалом, расходуемым на построение растущего плода. Там же установлена определенная связь между содержанием ртути в крови материнского организма и новорожденного. Можно высказать предположение, что эти явления характерны для других млекопитающих.
Пероральная затравка крыс ацетатом ртути сопровождалась накоплением ртути в головном мозге подопытных животных (влажный вес) от 9,00±1,10 мкг/кг (группа I) и 10,10±1,20 мкг/кг (группа II); в группе III – 2,70±0,20 мкг/кг и – 7,60±1,26 мкг/кг в группе IV (р<0,05). У опытных беременных крыс в тканях мозга ртути меньше, чем у небеременных, что можно было бы объяснить перераспределением ртути в кровь и ткани плода.
В мозге крысят, родившихся от опытных крыс (группа I), содержание ртути составило 3,90±0,10 мкг/кг, а у контрольных (группа III), т.е. не получавших ацетат ртути животных – 2,20±0,03 мкг/кг (р<0,05). Очевидно, что ртуть в ткани головного мозга крысят могла поступить из организма матери или в период внутриутробного развития, или при грудном вскармливании. В связи с этим может встать вопрос важного для педиатрии практического свойства – о возможности и последствиях грудного вскармливания новорожденных матерями, в крови которых обнаружено достаточно высокое содержание ртути. Впрочем, вопрос следовало бы ставить шире – последствия в развитии детей, родившихся от матерей, в анамнезе которых были контакты со ртутью.
4. Обсуждение
Полученные данные, приложенные к человеческой популяции, должны акцентировать внимание акушеров-гинекологов и педиатров на содержании ртути в крови молодых женщин как прогностического токсического для новорожденных фактора с ранних сроков беременности, а не только как токсического для организма матери фактора .
При анализе данных о содержании ртути в крови и тканях головного мозга контрольных животных – группы III и IV, необходимо объяснить ощутимую величину содержания токсиканта. Дело в том, что сухой корм для крыс (Рецепт № ПК-1200-2сх _324) содержащий рыбокостную муку, как показала аналитическая проверка, содержит ртуть, что и нашло отражение на результатах соответствующих измерений
Если попытаться, исходя из полученных данных, объяснить репродуктивную токсичность ртути, то, по-видимому, следует выделить два отличных друг от друга механизма. Первый – непосредственное токсическое действие ртути на органы и ткани животного, в том числе на нервную систему, что выражается в изменении поведенческих реакций взрослых крыс самок. Подобное по последствиям действие обнаруживается также у крысят. Во втором случае, по-видимому, задействованы эпигенетические механизмы, что отразилось на резком снижении плодовитости и продолжительности жизни крысят. Более определенная дискриминация этих двух механизмов потребовала бы экспериментов, исключающих попадание ртути в организм крысят из организма матери в период вынашивания плода и грудного вскармливания.
5. Заключение
Выводы:
1. Ацетат ртути в условиях пероральной затравки в суточной дозе 0,05LD50 вызывает значительное снижение плодовитости крыс и продолжительности жизни крысят, а также – изменяет поведенческие реакции крыс и крысят.
2. Состояние беременности существенно изменяет содержание ртути в крови в период гестации, перед родами концентрация ртути в крови более чем в два раза выше, чем в начале беременности.