Оценка нарушений функционального состояния ЦНС при исследовании комбинированного действия смесей диметилсульфоксида и диметилсульфида в подостром эксперименте
Оценка нарушений функционального состояния ЦНС при исследовании комбинированного действия смесей диметилсульфоксида и диметилсульфида в подостром эксперименте
Аннотация
Введение. Изучение комбинированного действия соединений серы, выделяющихся в атмосферный воздух из объектов размещения сульфидсодержащих отходов, представляется важным при идентификации опасности для здоровья экспонируемых групп населения.
Методы и принципы исследования. Комбинированное действие диметилсульфоксида (ДМСО) и диметилсульфида (ДМС) в составе 4-х смесей изучали на крысах-самцах линии Wistar. Животные, прошедшие карантин в течение 10 дней, содержались в однотипных условиях вивария на стандартном пищевом рационе. 1-я смесь включала ДМСО и ДМС в концентрации соответственно 0,741±0,1 и 0,674±0,04 мг/м3. 2-я смесь — 0,398±0,2 и 0,230±0,02 мг/м3 3-я смесь — 0,610±0,05 и 0,086±0,04 мг/м3, 4-я смесь — 0,09±0,03 и 0,085±0,09 мг/м3. Целевые уровни концентраций ДМСО и ДМС в затравочных камерах устанавливали с помощью ингалятора MED-121, для их определения использовали газоанализатор «ГАНК-4». Обследования подопытных животных проводили перед началом, на 14-й и 28-й дни эксперимента с помощью общепринятых и унифицированных методов.
Обсуждение. На основании полученных результатов, ДМСО и ДМС относятся к токсикологически сходным веществам, оказывающим преимущественное действие на ЦНС. В качестве предварительной оценки порога хронического действия можно рассматривать суммарную концентрацию ДМСО и ДМС в двухкомпонентных смесях, приближающуюся к семи величинам их гигиенических нормативов в атмосферном воздухе.
Основные результаты. На 14-й день экспозиции 1-й смесью у крыс обнаружено снижение уровней возбудимости ЦНС и горизонтальной двигательной активности, подтверждающее нейротоксичность. При этом более низкие концентрации ДМСО и ДМС не достигали порога нейротоксического действия. На 28-й день диагностировано снижение горизонтальной двигательной активности у животных 2 и 3-й групп, которые испытывали экспозицию ДМСО и ДМС в суммарной концентрации порядка 7 величин их ОБУВ/ПДК. Пороговый уровень нейротоксического действия индуцировал усиление катаболических процессов, что выразилось в повышении коэффициента де Ритиса и содержания в крови мочевины.
Заключение. Диагностированные нарушения функционального состояния ЦНС у подопытных животных являются критерием оценки опасности спектра фактических концентраций ДМСО и ДМС в атмосферном воздухе селитебных зон горнопромышленных районов и могут служить основой разработки технологии ранней диагностики вредных для здоровья эффектов в экспонируемых группах населения.
1. Введение
В настоящее время в районах разработки месторождений цветных и благородных металлов накоплены значительные количества сульфидсодержащих отходов, относящихся к группе наиболее опасных . Выведенные из эксплуатации объекты размещения таких отходов, остающиеся источниками загрязнения атмосферы сложными газоаэрозольными смесями, рассредоточены по многим регионам России . В постэксплуатационной период основная роль в генезисе атмосферной миграции специфичных токсичных продуктов из хвостохранилищ и отвалов переходит к природно-техногенным процессам, отражающим ответ природной среды на техногенное воздействие . К факторам генерация соединений серы относятся трансформация минеральной матрицы и физическо-химических свойств складированных сульфидсодержащих отходов, реализующаяся при участии биотических, неорганических и природно-климатических процессов , , , . Последующая эмиссия парогазовых смесей приводит к образованию атмохимических ореолов загрязнения, в определённых случаях охватывающих селитебные зоны горнопромышленных районов . В проведенных геохимических исследованиях , показано, что серьёзной проблемой для территорий риска таких районов является атмосферная миграция смесей ДМСО и ДМС, к одинаковым опасным свойствам которых относятся нейротоксические эффекты , .
Однако в научной литературе до настоящего времени не были отражены вопросы оценки характера комбинированного токсического действия ДМСО и ДМС при совместном ингаляционном поступлении в организм человека, что затрудняет идентификацию их опасности для общественного здоровья. Качественная и количественная оценка токсикодинамики смесей ДМСО и ДМС относительно постоянного состава, специфики их влияния на организм в концентрациях, близких к реально встречающимися в зонах загрязнения атмосферного воздуха, требуют применения экспериментального подхода.
Целью настоящей работы являлось изучение в эксперименте на животных специфики проявлений нейротоксических эффектов подпороговых концентраций диметилсульфоксида и диметилсульфида, выделяющихся атмосферный воздух из объектов размещения отходов переработки сульфидных руд в составе двухкомпонентных смесей.
2. Методы и принципы исследования
Комбинированное действие ДМСО и ДМС в составе двухкомпонентных смесей изучали на крысах-самцах линии Wistar, руководствовались методом «Оценка подострой токсичности при ингаляционном поступлении в 28-дневном исследовании». Животные, прошедшие карантин в течение 10 дней, содержались в однотипных условиях вивария на стандартном пищевом рационе. В качестве испытуемых веществ использовали ДМСО, CAS № 67-68-5 и ДМС, CAS №75-18-3. Создание испытуемых уровней концентраций данных веществ в стандартных 200-литровых затравочных камерах осуществляли с помощью ингалятора MED-121 (Китай). Для определения концентраций ДМСО и ДМС использовали газоанализатор «ГАНК-4» (Россия). Пробы воздуха отбирали из зоны дыхания животных с помощью пробоотборного зонда газоанализатора. Пределы основной относительной погрешности метода измерений составляют ±20%.
Для изучения характера комбинированного действия, в 28-дневном подостром опыте испытаны 4-е смеси ДМСО и ДМС относительно постоянного состава, различающиеся по концентрациям компонентов, которые позволяли получить градации эффектов воздействия между пороговым и действующим уровнями (табл. 1).
Таблица 1 - Концентрации компонентов смесей ДМСО и ДМС в затравочных камерах при ингаляционных затравках животных 1, 2, 3 и 4-й опытных групп
Концентрация | 1 группа, мг/м3 | 2 группа, мг/м3 | 3 группа, мг/м3 | 4 группа, мг/м3 |
ДМСО (CH3)2SO | 0,741±0,1 | 0,398±0,2 | 0,610±0,05 | 0,09±0,03 |
ДМС C2H6S | 0,674±0,04 | 0,230±0,02 | 0,086±0,04 | 0,085±0,09 |
Примечание: M±m
Экспериментальные исследования проводили в соответствии с действующими нормативно-методическими и руководящими документами , директивой 2010/63/EU Европейского парламента и Совета ЕС по охране животных, используемых в научных целях, после одобрения этическим комитетом Новосибирского НИИ гигиены (протокол № 4 от 8 сентября 2022 г.). Клинические, инструментальные и лабораторные обследования животных осуществляли перед началом (фоновое обследование), на 14-й и 28-й дни эксперимента с помощью общепринятых и унифицированных методов . Для оценки возбудимости ЦНС изучена динамика суммационно-порогового показателя (СПП) с помощью импульсного стимулятора ИСЭ-01 . Эмоционально-поведенческие реакции животных — горизонтальную и вертикальную двигательную активность (ГДА и ВДА), эмоциональную активность (ЭА), груминга реакции определяли с помощью метода «Открытое поле» . Перед началом затравок у крыс определены фоновые величины перечисленных показателей для установления физиологических уровней и равномерного распределения по группам. На 14 и 28-й дни после начала затравок измеряли массу тела животных, показатели возбудимости ЦНС и эмоционально-поведенческих реакций, гематологические и биохимические показатели крови, взятой из хвостовой вены . Концентрации в сыворотке крови мочевины, аланинаминотрансферазы (АЛТ) и аспартатаминотрансферазы (АСТ) измеряли на анализаторе биохимическом AU480 («Beckman Coulter», США) с использованием стандартных наборов. Статистическую обработку данных и построение графиков производили с помощью пакета прикладных программ Statistica 10.0 с использованием t-критерия Стьюдента для независимых выборок. Достоверными считали различия при p<0,05.
3. Основные результаты
Результаты изучения влияния 4-х целевых смесей ДМСО и ДМС на возбудимость центральной нервной системы (ЦНС) и эмоционально-поведенческие реакции подопытных животных на 14-й день ингаляционного воздействия представлены в таблице 2.
Таблица 2 - Влияние смесей ДМСО и ДМС на возбудимость ЦНС и эмоционально-поведенческие реакции животных на 14-й день подострого эксперимента
Показатели | Группы подопытных животных | |||
1 группа | 2 группа | 3 группа | 4 группа | |
ГДА, у.е. | 23,2 ± 1,0 * | 25,5 ± 1,0 | 27,4 ± 1,0 | 27,9 ± 1,2 |
ВДА, у.е. | 2,5 ± 0,6 | 3,2 ± 0,4 | 2,2 ± 0,3 | 1,9 ± 0,3 |
ЭА, у.е. | 2,2 ± 0,7 | 1,9 ± 0,8 | 2,4 ± 0,2 | 3,5 ± 0,6 |
Груминг, у.е. | 2,2 ± 0,9 | 4,6 ± 1,2 | 1,75 ± 0,9 | 2,75 ± 0,8 |
СПП, В | 10,0 ± 0,3 ** | 8,5 ± 0,3 | 9,0 ± 0,3 | 8,8 ± 0,2 |
Примечание: М±m. ГДА – горизонтальная двигательная активность, ВДА – вертикальная двигательная активность, ЭА – эмоциональная активность, груминг – груминга реакции, СПП – суммационно-пороговый показатель; * – отличия от данных контрольной группы достоверны, p<0,05; ** – отличия от данных контрольной группы достоверны, p<0,01
Видно, что в 1-й опытной группе, подвергавшейся максимальному ингаляционному воздействию ДМСО и ДМС, величина СПП достоверно выше уровню контроля (в 1,1 раза, p<0,01), что является признаком снижения возбудимости ЦНС. У животных 2-й, 3-й и 4-й опытных групп в этот срок подострого эксперимента значения СПП регистрировались достоверно ниже величины в 1-й опытной группе и не различались с контролем.
Полученное распределение величин СПП у подопытных животных подтверждает, что порог подострого ингаляционного действия смеси ДМСО и ДМС по влиянию на возбудимость ЦНС на 14-й день экспозиции близок к 16 величинам их гигиенических нормативов. Суммарные концентрации ДМСО и ДМС во 2, 3 и 4-й смесях, составляющие 6,9, 7,2 и 2,0 величин ОБУВ/ПДК, в стадии первичных реакций подострой интоксикации, в соответствии с зависимостью «концентрация-эффект», являются подпороговыми .
Из таблицы 3 видно, что на 28-й день экспозиции у животных 1-й опытной группы величины СПП существенно не отличались от значений в контроле, что объясняется формированием стадии адаптации подострой интоксикации .
Таблица 3 - Влияние смесей ДМСО и ДМС на возбудимость ЦНС и эмоционально-поведенческие реакции животных на 28-й день подострого эксперимента
Показатели | Группы подопытных животных | |||
1 группа | 2 группа | 3 группа | 4 группа | |
ГДА, у.е. | 23,3 ± 1,7 ** | 20,7 ± 0,9 ** | 25,3 ± 0,6 * | 30,5 ± 2,1 |
ВДА, у.е. | 3,3 ± 0,8 | 2,1 ± 0,7 | 2,3 ± 0,7 | 2,8 ± 1,5 |
ЭА, у.е. | 2,3 ± 0,4 | 1,5 ± 0,5 | 2,0 ± 0,6 | 2,0 ± 0,4 |
Груминг, у.е. | 11,3 ± 4,0 | 4,6 ± 1,5 | 9,0 ± 2,9 | 5,8 ± 2,6 |
СПП, В | 9,6 ± 0,4 | 8,7 ± 1,0 | 9,4 ± 0,6 | 9,0 ± 0,4 |
Примечание: М±m. ГДА – горизонтальная двигательная активность, ВДА – вертикальная двигательная активность, ЭА – эмоциональная активность, груминг – груминга реакции, СПП – суммационно-пороговый показатель; * – отличия от данных контрольной группы достоверны, p<0,05; ** – отличия от данных контрольной группы достоверны, p<0,01
У животных 2-й, 3-й и 4-й опытных групп в этот срок эксперимента статистических значимых различий с параллельным контролем в величинах СПП также не отмечалось (табл. 3). Нелинейный характер динамики изменения величин СПП в опытных группах в ходе 28-дневной экспозиции смесей ДМСО и ДМС представлен на рисунке 1.
Рисунок 1 - Динамика СПП у животных 1, 2, 3 и 4-й опытных групп (1, 2, 3, 4) и контрольной группы (К) в различные сроки подострого опыта
Рисунок 2 - Динамика средних величин горизонтальной двигательной активности у животных 1, 2, 3, 4-й опытных групп (1, 2, 3, 4) и контрольной группы (К) в различные сроки подострого опыта
Вместе с тем, на 28-й день экспозиции выявляется достоверное по отношению к уровню контроля снижение величин ГДА не только в 1-й, но и 2-й и 3-й опытных группах (табл. 3). Это свидетельствует о накоплении нейротоксического эффекта в результате 28-дневного ингаляционного воздействия смесей ДМСО и ДМС в суммарных концентрациях, близких к семи нормативным величинам . Статистическая обработка полученных данных показала отсутствие значимых различий в величинах ГДА во 2-й и 3-й опытных группах. Принимая во внимание сходные по силе эффекты воздействия 2-й и 3-я смесей, суммарные концентрации которых практически идентичны, двухкомпонентные смеси ДМСО и ДМС могут быть отнесены к смесям однородных веществ, к которым оправданно применение положения об изоаддитивности . В контексте токсикометрии, снижение величин ГДА во 2-й и 3-й опытных группах на 28-й день экспозиции указывает на функциональную кумуляцию ДМСО и ДМС, которая заключается в нарушении моторной функции ЦНС . Следствием накопления вредного эффекта является понижение порога нейротоксического действия двухкомпонентных смесей. Вместе с тем, оценка динамики величин ВДА, эмоциональной активности и груминга реакции в опытных группах на 14-й и 28-й день эксперимента достоверных различий с уровнями в контрольной группе не обнаружила, что указывает на парциальность нарушений функций ЦНС (табл. 2-3).
Анализ биохимических анализов крови крыс 1-й опытной группы, подвергающихся максимальной экспозиции ДМСО и ДМС, на 14-й день подострого опыта показал снижение (в 1,3 раза, р<0,01) активности АЛТ по отношению к уровню контроля (табл. 4).
Таблица 4 - Влияние смесей ДМСО и ДМС на концентрации в сыворотке крови животных мочевины, АЛТ, АСТ и соотношение АСТ/АЛТ на 14-й день подострого опыта
Группы животных | Величины показателей | |||
МН, ммоль/л | АЛТ, Е/л | АСТ, Е/л | АСТ/АЛТ, ед. | |
1-я опытная | 13,9±1,5 | 46,4±2,6 ** | 108,1±7,7 | 2,32±0,07 |
2-я опытная | 13,1±1,0 | 52,9±2,2 | 122,1±8,2 | 2,31±0,1 |
3-я опытная | 10,5±0,6 | 52,0±7,3 | 119,1±13,6 | 2,35±0,1 |
4-я опытная | 11,5±0,9 | 55,6±2,3 | 134,0±9,2 | 2,41±0,1 |
Контрольная | 10,5±0,9 | 60,0±3,3 | 125,6±8,4 | 2,12±0,1 |
Примечание: М±m. МН – мочевина крови, АЛТ – активность аланинаминотрансферазы, АСТ – активность аспартатаминотрансферазы, АСТ/АЛТ (соотношение активности АСТ/АЛТ, коэффициент де Ритиса); * – отличия от данных контрольной группы достоверны, p<0,05; ** – отличия от данных контрольной группы достоверны, p<0,01
При этом во 2-й, 3-й и 4-й опытных группах степень активности АЛТ существенно не отличалась от уровня контроля (табл. 4). Логично предположить, что ослабление активности АЛТ в результате ингаляционного воздействия 1-й смеси ДМСО и ДМС является признаком перестройки аминокислотного обмена, вызванной увеличением энерготрат экспонируемого организма . Это подтверждает напряжение механизмов, ответственных за развитие процесса адаптации биологической системы при экспозиции двухкомпонентной смеси ДМСО и ДМС в суммарной концентрации, близкой к порогу подострого действия . Анализ динамики активности в крови крыс 1-й опытной группы АЛТ на 28-й день экспозиции обнаружил её дальнейшее (1,5-кратное, р<0,05) снижение по отношению к уровню контроля (табл. 5).
Таблица 5 - Влияние смесей ДМСО и ДМС на концентрации в сыворотке крови животных мочевины, АЛТ, АСТ и соотношение АСТ/АЛТ на 28-й день подострого опыта
Группы животных | Величины показателей | |||
МН, ммоль/л | АЛТ, Е/л | АСТ, Е/л | АСТ/АЛТ, ед. | |
1-я опытная | 17,9±3,2 * | 41,6±7,1 * | 124,0±19,8 | 2,84±0,3 * |
2-я опытная | 14,7±1,5 | 62,6±3,3 | 154,9±8,1 | 2,48±0,08 ** |
3-я опытная | 13,4±0,7 | 43,4±3,8 | 98,4±8,2 | 2,30±0,1 |
4-я опытная | 9,06±1,2 | 53,6±5,3 | 127,8±10,5 | 2,14±0,3 |
Контрольная | 10,9±0,9 | 65,6±5,9 | 130,4±12,9 | 2,0±0,1 |
Примечание: М±m. МН – мочевина крови, АЛТ – активность аланинаминотрансферазы, АСТ – активность аспартатаминотрансферазы, АСТ/АЛТ (соотношение активности АСТ/АЛТ, коэффициент де Ритиса); * – отличия от данных контрольной группы достоверны, p<0,05; ** – отличия от данных контрольной группы достоверны, p<0,01
Анализ активности в сыворотке крови АСТ на 14-й и 28-й дни эксперимента не выявил статистически значимых различий в уровнях у крыс опытных и контрольной групп. Вместе с тем, на 28-й день подострого опыта отмечено увеличение значений соотношения АСТ/АЛТ в 1-й и 2-й опытных группах, достоверное по отношению к величине в контроле (соответственно, в 1,4 раза, р<0,05 и 1,2 раза, р<0,01). Увеличение коэффициента де Ритиса у крыс является значимым маркером активации процессов обмена аминокислот и глюконеогенеза . В этом контексте является закономерным увеличение содержания в крови крыс 1-й опытной группы мочевины (в 1,6 раза, р<0,05), подтверждающее усиление катаболических процессов. Графический анализ показал, что тенденция к изменению содержания мочевины в крови животных опытных групп носит дозозависимый характер, вместе с тем не достигающий уровня значимости во 2-й, 3-й и 4-й группах.
4. Обсуждение
В настоящее время постулируется, что изучение комбинированного токсического действия при совместном присутствии в атмосферном воздухе химических веществ, в том числе смесей постоянного состава, оправданно проводить на уровне и ниже максимальных недействующих концентраций отдельных компонентов . В связи с этим исследовалось комбинированное действие ДМСО и ДМС в 4-х концентрациях, являющихся, по данным литературы подпороговыми , . Принимая во внимание преимущественное действие на центральную нервную систему, ДМСО и ДМС рассматривались как токсикологически сходные вещества . Особенности экспериментальных проявлений нейротоксичности, состоящей в однотипном изменении у подопытных крыс показателей функционального состояния ЦНС, принимались за доказательства однородного действия, совпадение манифестированных эффектов смесей с идентичными суммарными значениями кратностей превышения нормативов — за однонаправленное (синергическое) действие . В качестве рабочей гипотезы принято предположение о том, что 2-я и 3-я смеси, имеющие примерно одинаковые суммарные значения кратностей превышения гигиенических нормативов в атмосферном воздухе ДМСО и ДМС, установленных соответственно на уровнях 0,1 и 0,08 мг/м3, являются качественно эквивалентными, компоненты которых взаимозаменяемы. В случае выявления различий в величинах эффектов, предполагалось введение коэффициента аддитивности К, определяющего величину отклонения от аддитивности: если К>1, то комбинированное действие является более чем аддитивным, если К<1 — менее чем аддитивным .
Сопоставление концентраций ДМСО и ДМС в 1-й смеси, равных соответственно 0,741±0,1 мг/м3 и 0,674±0,04 мг/м3, со справочными (литературными) сведениями о порогах их хронического изолированного действия, представленных на уровнях соответственно 120 мг/м3 и 26 мг/м3 , , давало основания полагать, что вредные эффекты от её воздействия могут возникать только в случае более чем аддитивного действия компонентов. Ещё в большей мере это предположение относится к концентрациям ДМСО и ДМС во 2-й, 3-й и 4-й смесях, установленных на уровнях существенно ниже порогов действия. Вместе с тем, снижение порога действия на заключительном этапе подострого опыта может определяться накоплением нейротоксического эффекта смесей ДМСО и ДМС, которое обозначается феноменом функциональной кумуляции . В таком случае, значимым подтверждением порогового и надпорогового уровней воздействия смесей является усиление катаболизма аминокислот и белков, за счёт которого обеспечиваются возрастающие энергетические потребности экспонируемого организма.
5. Заключение
Таким образом, изучение комбинированного токсического действия ДМСО и ДМС в условиях 28-дневной экспозиции белых крыс-самцов подтвердило нейротоксическое действие двухкомпонентных смесей и более чем аддитивное действие ДМСО и ДМС при совместном присутствии в воздушной среде в концентрациях, близких к недействующим. В контексте настоящего исследования, суммарное значение кратностей превышения гигиенических нормативов ДМСО и ДМС в атмосферном воздухе, приближающееся к 7, может рассматриваться в качестве предварительной оценки порога хронического действия целевых двухкомпонентных смесей. При указанном фактическом и прогнозном уровнях загрязнения атмосферного воздуха смесью ДМСО и ДМС целесообразно проведение исследования причинно-следственных связей между состоянием здоровья населения и воздействием аэрогенного химического фактора.
Установление специфичности связи между обозначенным химическим фактором и нарушениями возбудимости ЦНС, эмоционально-поведенческих реакций у подопытных животных относится к решающим условиям при переносе знания с модели на объект исследования, которым является общественное здоровье. Одновременно, обнаруженные изменения диагностических тестов, отражающие характер ответа модельного организма на подострое ингаляционное воздействие смесей ДМСО и ДМС, представляют значимость в качестве одного из критериев оценки опасности спектра их фактических концентраций в атмосферном воздухе селитебных зон горнопромышленных районов и могут служить основой разработки технологии ранней диагностики вредных для здоровья эффектов в экспонируемых контингентах населения.