CITOKINES AND NEUROSPECIFIC PROTEINS IN PATIENTS WITH ALCOHOL DEPENDENCE SYNDROME
CITOKINES AND NEUROSPECIFIC PROTEINS IN PATIENTS WITH ALCOHOL DEPENDENCE SYNDROME
Abstract
The imbalance of cytokines and neurotrophic factors resulting from the effects of ethanol plays a key role in the development of alcohol dependence. The article presents data on the content of circulating cytokines (IL-1β, -4, -6, -10, TNF-α), neuronal structural proteins (NSE, pTau), glial biomarkers (GFAP, MBP, S-100B) and neurotrophin (BDNF) in 20 patients with a verified diagnosis of alcohol dependence syndrome. Compared to healthy individuals, a statistically significant decrease in the content of total myelin basic protein (MBP) and calcium-binding protein S-100B was observed in the plasma of patients, along with an increase in the concentration of brain-derived neurotrophic factor (BDNF). At the same time, in males who abuse alcohol, the concentration of BDNF is higher than in female patients.
1. Введение
Алкогольная зависимость является серьезной и многогранной проблемой общественного здоровья, имеющей значительные социальные и экономические последствия. Согласно данным Национального статистического комитета, в Республике Беларусь в 2023 году численность лиц c алкогольной зависимостью, состоящих под диспансерным наблюдением в организациях здравоохранения, составляла 1 773,4 человек на 100 000 населения. Ежегодно данный диагноз устанавливается впервые около 14 200 человек (154,7 лиц на 100 000 населения) . Чрезмерное употребление алкоголя относится к ведущим причинам, способствующим возникновению различных заболеваний и преждевременной смерти (до 5% от общей летальности населения). Существующие методы терапии алкогольной зависимости, как правило, не являются гарантией стойкой ремиссии. В течение первых шести месяцев вероятность срыва ремиссии наблюдается у 60% пациентов .
Алкоголь влияет на ключевые свойства центральной нервной системы: возбудимость, синаптическую передачу, пластичность. Развитие синдрома алкогольной зависимости сопровождается нарушением нейрональных цепей, дисбалансом иммунных и гормональных факторов, нейромедиаторов, а также структурными изменениями тканей головного мозга , , , .
Изучение нейроиммунных аспектов формирования алкогольной зависимости, а также оценка взаимосвязи между структурно-функциональными нарушениями нервной системы и клинико-лабораторными особенностями пациентов позволит объяснить патогенез расстройств, связанных с употреблением психоактивных веществ. Кроме того, актуальной проблемой остается поиск биологических маркеров для оценки эффективности терапии при алкогольной зависимости и прогноза длительности терапевтической ремиссии.
Цель — изучить содержание циркулирующих про/противовоспалительных цитокинов и нейроспецифических белков у пациентов с синдромом зависимости от алкоголя.
2. Методы и принципы исследования
Исследуемую группу составили пациенты с алкогольной зависимостью, состоящие на наркологическом учёте в учреждении здравоохранения «Минский областной клинический центр «Психиатрия-наркология». Включение пациентов в исследование осуществлялось в соответствии со следующими критериями: верифицированный по МКБ-10 диагноз F10.2 «синдром зависимости от алкоголя», наличие письменного информированного согласия, отсутствие в анамнезе черепно-мозговых травм, органических заболеваний головного мозга, неврологических, аутоиммунных, онкологических патологий, иных психических расстройств, отсутствие в течение 1 месяца до забора биологического материала клинико-лабораторных проявлений острых и хронических инфекционных заболеваний любой природы, а также явных признаков аллергических процессов, отсутствие травм и оперативных вмешательств, а также терапии психотропными препаратами в течение последних 6 месяцев.
Диагноз «синдром зависимости от алкоголя» верифицировался при наличии у пациентов на протяжении месяца или периодически повторяющихся в течение 12 месяцев трех или более следующих критериев: сильное или непреодолимое желание употребить алкоголь, затруднённый контроль приёма алкоголя, абстинентный синдром при прекращении приема или снижении дозы, признаки толерантности к алкоголю, прогрессирующее пренебрежение альтернативными удовольствиями или интересами, а также продолжение употребления, несмотря на очевидные пагубные последствия.
В исследуемую группу отобрано 20 пациентов в возрасте от 20 до 40 лет (средний возраст 31±5 лет), из них 12 (60%) мужчин и 8 (40%) женщин. Все пациенты на момент исследования получали только психотерапевтическую помощь. Период от последнего употребления алкоголя составлял не менее 7 дней и соответствовал по медиане 38 (19–60) дней.
В группу сравнения включали 20 здоровых добровольцев, сопоставимых по возрасту и полу, которые по данным анамнеза не имели психических и поведенческих расстройств, в том числе связанных с употреблением психоактивных веществ, у них отсутствовали черепно-мозговые травмы, органические заболевания головного мозга, неврологические, аутоиммунные, онкологические патологии, кроме того, в течение 1 месяца до забора материала не было клинико-лабораторных признаков острых и хронических инфекций, аллергических патологий, а в течение последних 6 месяцев отсутствовали травмы и оперативные вмешательства.
Концентрации цитокинов (ИЛ-1β, -4, -6, -10, ФНО-α) и нейроспецифических белков (BDNF, MBP, pTau, S-100B, NSE, GFAP) определяли в плазме крови методом твердофазного иммуноферментного анализа с использованием коммерческих тест-систем производства «Вектор-Бест» (РФ) и "Fine Test" (КНР), соответственно. Результаты регистрировали спектрофотометрически с использованием микропланшетного фотометра Multiskan SkyHigh ("Thermo Scientific", Финляндия).
Статистический анализ данных проводили с использованием стандартного пакета прикладной программы Statistica 10.0. Полученные данные представляли в виде медианы и интерквартильного размаха (25-й÷75-й процентили). Для оценки различий между двумя независимыми группами использовали непараметрический U-критерий Манна-Уитни. Корреляционный анализ проводили с помощью коэффициента ранговой корреляции Спирмена (rs). Различия считались статистически значимыми при уровне значимости (р) менее 0,05.
3. Основные результаты
3.1. Цитокиновый профиль пациентов с синдромом зависимости от алкоголя
Нервная, эндокринная и иммунная системы находятся в тесной взаимосвязи, обеспечивая поддержание гомеостаза организма . Патологические изменения в нервной системе, в том числе возникающие под влиянием острого и хронического употребления алкоголя, приводят к иммунной дисрегуляции и высвобождению ключевых сигнальных белков — цитокинов. Как в экспериментальных, так и клинических работах описана связь употребления алкоголя с уровнем цитокинов: ИЛ-1β, -8, -17, -10, белок хемотаксиса моноцитов-1 (МСР-1), фактор некроза опухоли-α (ФНОα) и так далее , , , .
В условиях алкогольной интоксикации эффекты цитокинов разнообразны. С одной стороны, изменение их локальных концентраций оказывает повреждающее действие на нейроны, индуцирует и поддерживает нейровоспаление , , . С другой стороны, имеются данные о связи уровня цитокинов в кровотоке с развитием алкоголь-обусловленных когнитивных и поведенческих расстройств, а также с формированием психологических симптомов зависимости (например, тяга к алкоголю) , . Кроме того, у лиц, злоупотребляющих алкоголем, нарушение цитокинового баланса увеличивает риск развития иммуноопосредованных заболеваний, сопровождающихся хроническим воспалением (алкогольный гепатит, цирроз печени, панкреатит и другие) .
В таблице 1 представлены результаты определения концентраций про– и противовоспалительных цитокинов в системном кровотоке 17 пациентов с верифицированным диагнозом «синдром зависимости от алкоголя».
Таблица 1 - Концентрации цитокинов в плазме пациентов с синдромом зависимости от алкоголя
Показатель | Исследуемая группа, нг/л | Группа сравнения, нг/л | Уровень значимости, р |
ИЛ-10 | 2,50 (1,94–2,70) | 2,22 (2,17–3,48) | 0,69 |
ИЛ-4 | 0,63 (0,40–0,97) | 0,73 (0,46–1,14) | 0,35 |
ИЛ-6 | 1,31 (1,00–1,48) | 1,18 (0,90–1,34) | 0,41 |
ИЛ-1β | 0,67 (0,57–0,89) | 0,80 (0,69–0,96) | 0,31 |
ФНО-α | 1,45 (1,36–1,67) | 1,65 (1,30–1,86) | 0,42 |
Статистически значимых отличий между концентрациями ИЛ-10, -4,-6, -1β и ФНОα в группах пациентов с синдромом зависимости от алкоголя и здоровыми лицами не установлено.
Для оценки баланса цитокинов использовалось соотношение концентраций провоспалительного ИЛ-1β к противовоспалительному ИЛ-10. У пациентов с алкогольной зависимостью соотношение ИЛ-1β/ИЛ-10 составляло 0,30 (0,22–0,39) усл. ед. и статистически значимо не отличалось от аналогичного показателя в группе сравнения (0,38 (0,22–0,43) усл. ед., p>0,05). При этом, установлена положительная корреляционная связь между периодом от последнего употребления алкоголя (дни) и значением соотношения ИЛ-1β/ИЛ-10 (rs = 0,65, p<0,05), что свидетельствует о превалировании провоспалительного иммунного ответа в первые дни после алкогольной интоксикации и стабилизации баланса цитокинов со временем. Интерлейкин-1 обладает плейотропным характером биологической активности и регулирует все стороны воспалительной реакции, в то время как ИЛ-10 проявляет противовоспалительные и иммуносупрессивные эффекты, в том числе ингибирует избыточный синтез провоспалительных факторов.
Следует отметить, что данные об изменении содержания циркулирующих цитокинов у пациентов с алкогольной зависимостью достаточно разрознены. В большинстве исследований отмечалось повышение содержания провоспалительных цитокинов (ИЛ-1β, ИЛ-6, ИЛ-8, ФНОα, интерферон-γ) на фоне снижения противовоспалительных факторов (ИЛ-4, ИЛ-10) , , , . При этом оценка динамики изменения цитокинов осуществлялась на высоте психотического эпизода (алкогольный делирий) или в короткий период после приема алкоголя (от нескольких часов до 3 дней), что отражает лишь временный иммунный ответ. Имеются данные о том, что уже через 24 часа после употребления алкоголя содержание цитокинов в кровотоке не отличается от исходного уровня. Кроме того, в работах с использованием культур клеток показана связь уровня продукции цитокинов с дозой и продолжительностью воздействия этанола, что сложно учитывать при проведении клинических исследований .
В данной работе на момент забора биологического материала у пациентов не было проявлений алкогольной интоксикации, а период от последнего употребления алкоголя составлял не менее 7 дней. Отсутствие статистически значимых изменений в концентрации цитокинов у таких пациентов может свидетельствовать о стабилизации нервно-иммунного взаимодействия в период отмены алкоголя, что проявляется достижением баланса между иммунологической толерантностью и развитием иммунообусловленных воспалительных реакций.
3.2. Содержание нейронных и глиальных биомаркеров в плазме пациентов с синдромом зависимости от алкоголя
Среди биохимических маркеров развития алкогольной зависимости активно исследуются нейроспецифические белки, которые выполняют множество интегративных функций, а их уровень в биологических жидкостях (сыворотке, ликворе) отражает степень патологических изменений в нейрональных и глиальных компонентах головного мозга.
Нейрон-специфическая энолаза (англ. "neuron-specific enolase", NSE) содержится в цитоплазме зрелых нейронов, обладает нейротрофическими и нейропротекторными свойствами. Повышение количества данного гликолитического фермента ассоциируют с уровнем нейрональной гибели . Концентрация NSE в плазме пациентов с синдромом зависимости от алкоголя составляла 7,3 (3,3–15,2) нг/мл и статистически значимо не отличалось от значений данного показателя в группе сравнения (12,1 (5,7–19,0) нг/мл), р=0,14). Сходные результаты получены и для еще одного структурного белка нейронов. Содержание фосфорилированного Tau-белка (pTau) в плазме пациентов соответствовало 2,8 (2,4–39,9) нг/л, а в группе здоровых лиц — 4,6 (3,8–38,4) нг/л, р=0,18. Таu-белок ассоциирован с микротрубочками нейронов, участвует в транспорте веществ и поддержании клеточной структуры. За счет процессов фосфолирирования Tau-белок регулирует как нормальные, так и патологические клеточные процессы. Так, при гиперфосфолирировании ухудшается способность Таu-белка связываться с микротрубочками, происходит образование нейрофибриллярных клубков, что может инициировать и поддерживать процессы нейродегенерации .
Повреждение нервной системы, сопровождающееся нейрональной деструкцией и развитием нейровоспаления, приводит к активации функций глиальных клеток с целью восстановления головного мозга. Результаты определения содержания биомаркеров глиальных клеток в кровотоке пациентов с алкогольной зависимостью отражены в таблице 2.
Таблица 2 - Содержание биомаркеров активации нейроглии в плазме пациентов с синдромом зависимости от алкоголя
Показатель | Исследуемая группа, нг/л | Группа сравнения, нг/л | Уровень значимости, р |
GFAP | 66,2 (49,0–92,2) | 71,3 (42,1–95,3) | 0,89 |
MBP | 135,0 (120,4–170,2) | 180,3 (160,2–240,1) | 0,02 |
S-100B | 9,1 (7,6–12,7) | 25,5 (12,3–29,9) | 0,01 |
Концентрация глиального фибриллярного кислого белка (англ. "glial fibrillary acidic protein", GFAP) в плазме исследуемых групп статистически значимо не отличалась. GFAP относится к группе белков промежуточного филамента III, экспрессируется в астроцитах и участвует в регуляции процессов, связанных с пролиферацией клеток, синаптической пластичностью, а также с функцией гематоэнцефалического барьера .
Установлено снижение концентраций общего белка миелина (англ. "myelin basic protein", MBP) и кальция-связывающего протеина S-100B у пациентов с синдромом зависимости от алкоголя по сравнению со здоровыми лицами (р<0,05, таблица 2). В центральной нервной системе 80% белка S100 содержится в глиальных клетках, остальные 20% характерны для нейронов. Основные функции S100 заключаются в поддержании гомеостаза кальция, регуляции пролиферации и дифференциации клеток, инициации формирования клеточного цитоскелета.
Основной белок миелина локализуется в мембране олигодендроцитов и их отростках. Кроме того, МВР составляет основную массу белкового компонента миелиновых оболочек. Именно миелин обеспечивает скачкообразное распространение потенциала действия, в результате чего аксоны быстрее и более энергоэффективно передают нервный импульс по сравнению с немиелинизированными волокнами. Структурные и количественные изменения миелина приводят к дисрегуляции различных нейронных цепей, что сопровождается сенсорными и двигательными нарушениями, а также затрагивает высшие функции мозга. Данные Harper C. (2009), полученные посмертно, свидетельствуют о наличии у лиц, злоупотребляющих алкоголем, признаков демиелинизации . C помощью просвечивающей электронной микроскопии обнаружены изменения ультраструктуры миелина в головном мозге пациентов с алкогольной зависимостью . Кроме того, у лабораторных животных, находящихся в условиях хронического употребления алкоголя, выявлено изменение состава миелиновых оболочек, в том числе снижение уровня экспрессии MBP .
Выявленное снижение концентрации MBP в плазме пациентов может быть косвенным признаком повреждения олигодендроцитов и миелиновых оболочек нервных клеток, что возможно в результате прямого токсического действия алкоголя и/или в ходе нарушения обмена веществ, затрагивающего процессы синтеза и утилизации миелина.
3.3. Нейротрофический фактор головного мозга в плазме пациентов с синдромом зависимости от алкоголя
Нейротрофический фактор головного мозга (англ. "brain-derived neurotrophic factor", BDNF) является ключевым нейробелком, обуславливающим молекулярные, структурные и функциональные нарушения головного мозга, возникающие при расстройствах, связанных с употреблением психоактивных вещества. BDNF представлен несколькими активными изоформами, взаимодействующими с различными рецепторами и запускающими многочисленные сигнальные пути, что определяет многообразие биологического действия. Данный нейротрофин участвует в различных нейробиологических процессах, включая рост нейронов, дифференцировку и синаптическую пластичность , .
Нейротрофический фактор головного мозга синтезируется во всех отделах центральной нервной системы и способен преодолевать гематоэнцефалический барьер, на долю такого белка приходится около 75% от количества циркулирующего BDNF. В связи с этим, уровни BDNF в кровотоке считаются косвенным показателем высвобождения его в головном мозге. Вне нервной системы BDNF синтезируется и высвобождается лейкоцитами, эндотелиальными клетками, кардиомиоцитами, мышечными клетками, клетками печени, легких, сердца, а также другими тканями.
Результаты количественных исследований циркулирующего BDNF обладают достаточно широкой вариабельностью, так как точность измерения в данном случае зависит от множества факторов: типа используемых антикоагулянтов, продолжительности свертывания крови, температурных условий, гормональных колебаний, времени перед центрифугированием биологического образца , . В рамках данного исследования взятие периферической крови осуществляли строго в утреннее время (8–10 часов) натощак с доставкой материала для первичной обработки в течении 3 часов при температуре 2–8° С. В качестве антикоагулянта использовалась динатриевая соль этилендиаминтетрауксусной кислоты (1,2 мг/мл крови),образцы подвергались хранению при -70°С. Использование плазмы крови для количественного определения нейротрофина позволило исключить фракцию BDNF, который связывается тромбоцитами посредством рецептор-опосредованного эндоцитоза и высвобождается во время свертывания крови.
Полученные результаты отражены на рисунке 1. У пациентов с синдромом зависимости от алкоголя концентрация циркулирующего BDNF составляла 182,3 (116,7–229,4) нг/л, тогда как в группе сравнения — 127,7 (87,9–149,1) нг/л, р=0,04. При этом, у пациентов с алкогольной зависимостью более высокие значения BDNF были характерны для лиц мужского пола (211,5 (182,3–237,8) нг/л vs. 123,5 (94,9–187,1) нг/л у пациентов женского пола, р=0,04).
Рисунок 1 - Концентрация нейротрофического фактора головного мозга в плазме пациентов с синдромом зависимости от алкоголя
Влияние клинико-лабораторных данных пациентов на уровень и функции BDNF отмечено в ряде исследований. Выявлено снижение концентраций нейротрофина у пациентов, страдающих депрессией, а также у лиц с высоким индексом массы тела , . В данном исследовании показано, что более низкие значения BDNF при алкогольной зависимости характерны для пациентов женского пола по сравнению с лицами мужского пола. Полученные результаты могут свидетельствовать о регулирующем влиянии стероидных гормонов и менструальных периодов на содержание данного пептида в кровотоке.
4. Заключение
По сравнению со здоровыми лицами в плазме пациентов с синдромом зависимости от алкоголя отмечалось снижение содержания глиальных биомаркеров MBP и S-100B, повышение нейротрофического фактора BDNF (р<0,05), тогда как концентрации цитокинов (ИЛ-10, -4,-6, -1β, ФНОα) и нейроспецифических белков (NSE, pTau) не имели статистически значимых отличий. Установлена зависимость между уровнем BDNF и половой структурой пациентов. У лиц мужского пола концентрация нейротрофина выше аналогичного показателя у пациентов женского пола, р<0,05. Полученные результаты могут свидетельствовать о повреждении у пациентов миелиновых оболочек нервных клеток, а также об активации у них BDNF-зависимых нейрокомпенсаторных механизмов, направленных на снижение мотивации потребления алкоголя.
Определение биомаркеров в биологических жидкостях пациентов, злоупотребляющих алкоголем, может явиться перспективной стратегией для мониторинга течения заболевания, прогнозирования повторных срывов, оценки тяжести абстинентного синдрома, а также для разработки новых терапевтических стратегий.