Assessment of CNS functional disorders in the study of the combined effect of dimethyl sulfoxide and dimethyl sulfide mixtures in a subacute experiment
Assessment of CNS functional disorders in the study of the combined effect of dimethyl sulfoxide and dimethyl sulfide mixtures in a subacute experiment
Abstract
Introduction. The study of the combined effects of sulfur compounds released into the atmospheric air from facilities where sulfide-containing waste is disposed of is important for identifying health hazards for exposed populations.
Research methods and principles. The combined effect of dimethyl sulfoxide (DMSO) and dimethyl sulfide (DMS) in 4 mixtures was studied on male Wistar rats. The animals, which had been quarantined for 10 days, were kept in the same vivarium conditions and fed a standard diet. The 1st mixture included DMSO and DMS at concentrations of 0,741±0,1 and 0,674±0,04 mg/m3, respectively. The 2nd mixture was 0,398±0,2 and 0,230±0,02 mg/m3, the 3rd mixture was 0,610±0,05 and 0,086±0,04 mg/m3, the 4th mixture was 0,09±0,03 and 0,085±0,09 mg/m3. Target concentrations of DMSO and DMS in the priming chambers were set using a MED-121 inhaler, and a "GANK-4" gas analyzer was used to determine them. The experimental animals were examined before the experiment, on days 14 and 28, using standard and unified methods.
Discussion. Based on the results obtained, DMSO and DMS are toxicologically similar substances that have a predominant effect on the central nervous system. As a preliminary assessment of the threshold of chronic action, the total concentration of DMSO and DMS in two-component mixtures can be considered to be approaching seven times their hygienic standards in atmospheric air.
Main results. On the 14th day of exposure to the 1st mixture, rats showed a decrease in CNS excitability and horizontal motor activity, confirming neurotoxicity. However, lower concentrations of DMSO and DMS did not reach the neurotoxic threshold. On the 28th day, animals in groups 2 and 3, which were exposed to DMSO and DMS at a total concentration of approximately 7 times their SRLI/ MPC, showed a decrease in horizontal motor activity. The threshold level of neurotoxic effect induced an increase in catabolic processes, which was reflected in an increase in the de Ritis coefficient and blood urea content.
Conclusion. The diagnosed disorders of the CNS functional state in experimental animals are a criterion for assessing the danger of the spectrum of actual concentrations of DMSO and DMS in the atmospheric air of residential areas of mining districts and can serve as a basis for developing technology for early diagnosis of harmful effects on health in exposed population groups.
1. Введение
В настоящее время в районах разработки месторождений цветных и благородных металлов накоплены значительные количества сульфидсодержащих отходов, относящихся к группе наиболее опасных . Выведенные из эксплуатации объекты размещения таких отходов, остающиеся источниками загрязнения атмосферы сложными газоаэрозольными смесями, рассредоточены по многим регионам России . В постэксплуатационной период основная роль в генезисе атмосферной миграции специфичных токсичных продуктов из хвостохранилищ и отвалов переходит к природно-техногенным процессам, отражающим ответ природной среды на техногенное воздействие . К факторам генерация соединений серы относятся трансформация минеральной матрицы и физическо-химических свойств складированных сульфидсодержащих отходов, реализующаяся при участии биотических, неорганических и природно-климатических процессов , , , . Последующая эмиссия парогазовых смесей приводит к образованию атмохимических ореолов загрязнения, в определённых случаях охватывающих селитебные зоны горнопромышленных районов . В проведенных геохимических исследованиях , показано, что серьёзной проблемой для территорий риска таких районов является атмосферная миграция смесей ДМСО и ДМС, к одинаковым опасным свойствам которых относятся нейротоксические эффекты , .
Однако в научной литературе до настоящего времени не были отражены вопросы оценки характера комбинированного токсического действия ДМСО и ДМС при совместном ингаляционном поступлении в организм человека, что затрудняет идентификацию их опасности для общественного здоровья. Качественная и количественная оценка токсикодинамики смесей ДМСО и ДМС относительно постоянного состава, специфики их влияния на организм в концентрациях, близких к реально встречающимися в зонах загрязнения атмосферного воздуха, требуют применения экспериментального подхода.
Целью настоящей работы являлось изучение в эксперименте на животных специфики проявлений нейротоксических эффектов подпороговых концентраций диметилсульфоксида и диметилсульфида, выделяющихся атмосферный воздух из объектов размещения отходов переработки сульфидных руд в составе двухкомпонентных смесей.
2. Методы и принципы исследования
Комбинированное действие ДМСО и ДМС в составе двухкомпонентных смесей изучали на крысах-самцах линии Wistar, руководствовались методом «Оценка подострой токсичности при ингаляционном поступлении в 28-дневном исследовании». Животные, прошедшие карантин в течение 10 дней, содержались в однотипных условиях вивария на стандартном пищевом рационе. В качестве испытуемых веществ использовали ДМСО, CAS № 67-68-5 и ДМС, CAS №75-18-3. Создание испытуемых уровней концентраций данных веществ в стандартных 200-литровых затравочных камерах осуществляли с помощью ингалятора MED-121 (Китай). Для определения концентраций ДМСО и ДМС использовали газоанализатор «ГАНК-4» (Россия). Пробы воздуха отбирали из зоны дыхания животных с помощью пробоотборного зонда газоанализатора. Пределы основной относительной погрешности метода измерений составляют ±20%.
Для изучения характера комбинированного действия, в 28-дневном подостром опыте испытаны 4-е смеси ДМСО и ДМС относительно постоянного состава, различающиеся по концентрациям компонентов, которые позволяли получить градации эффектов воздействия между пороговым и действующим уровнями (табл. 1).
Таблица 1 - Концентрации компонентов смесей ДМСО и ДМС в затравочных камерах при ингаляционных затравках животных 1, 2, 3 и 4-й опытных групп
Концентрация | 1 группа, мг/м3 | 2 группа, мг/м3 | 3 группа, мг/м3 | 4 группа, мг/м3 |
ДМСО (CH3)2SO | 0,741±0,1 | 0,398±0,2 | 0,610±0,05 | 0,09±0,03 |
ДМС C2H6S | 0,674±0,04 | 0,230±0,02 | 0,086±0,04 | 0,085±0,09 |
Примечание: M±m
Экспериментальные исследования проводили в соответствии с действующими нормативно-методическими и руководящими документами , директивой 2010/63/EU Европейского парламента и Совета ЕС по охране животных, используемых в научных целях, после одобрения этическим комитетом Новосибирского НИИ гигиены (протокол № 4 от 8 сентября 2022 г.). Клинические, инструментальные и лабораторные обследования животных осуществляли перед началом (фоновое обследование), на 14-й и 28-й дни эксперимента с помощью общепринятых и унифицированных методов . Для оценки возбудимости ЦНС изучена динамика суммационно-порогового показателя (СПП) с помощью импульсного стимулятора ИСЭ-01 . Эмоционально-поведенческие реакции животных — горизонтальную и вертикальную двигательную активность (ГДА и ВДА), эмоциональную активность (ЭА), груминга реакции определяли с помощью метода «Открытое поле» . Перед началом затравок у крыс определены фоновые величины перечисленных показателей для установления физиологических уровней и равномерного распределения по группам. На 14 и 28-й дни после начала затравок измеряли массу тела животных, показатели возбудимости ЦНС и эмоционально-поведенческих реакций, гематологические и биохимические показатели крови, взятой из хвостовой вены . Концентрации в сыворотке крови мочевины, аланинаминотрансферазы (АЛТ) и аспартатаминотрансферазы (АСТ) измеряли на анализаторе биохимическом AU480 («Beckman Coulter», США) с использованием стандартных наборов. Статистическую обработку данных и построение графиков производили с помощью пакета прикладных программ Statistica 10.0 с использованием t-критерия Стьюдента для независимых выборок. Достоверными считали различия при p<0,05.
3. Основные результаты
Результаты изучения влияния 4-х целевых смесей ДМСО и ДМС на возбудимость центральной нервной системы (ЦНС) и эмоционально-поведенческие реакции подопытных животных на 14-й день ингаляционного воздействия представлены в таблице 2.
Таблица 2 - Влияние смесей ДМСО и ДМС на возбудимость ЦНС и эмоционально-поведенческие реакции животных на 14-й день подострого эксперимента
Показатели | Группы подопытных животных | |||
1 группа | 2 группа | 3 группа | 4 группа | |
ГДА, у.е. | 23,2 ± 1,0 * | 25,5 ± 1,0 | 27,4 ± 1,0 | 27,9 ± 1,2 |
ВДА, у.е. | 2,5 ± 0,6 | 3,2 ± 0,4 | 2,2 ± 0,3 | 1,9 ± 0,3 |
ЭА, у.е. | 2,2 ± 0,7 | 1,9 ± 0,8 | 2,4 ± 0,2 | 3,5 ± 0,6 |
Груминг, у.е. | 2,2 ± 0,9 | 4,6 ± 1,2 | 1,75 ± 0,9 | 2,75 ± 0,8 |
СПП, В | 10,0 ± 0,3 ** | 8,5 ± 0,3 | 9,0 ± 0,3 | 8,8 ± 0,2 |
Примечание: М±m. ГДА – горизонтальная двигательная активность, ВДА – вертикальная двигательная активность, ЭА – эмоциональная активность, груминг – груминга реакции, СПП – суммационно-пороговый показатель; * – отличия от данных контрольной группы достоверны, p<0,05; ** – отличия от данных контрольной группы достоверны, p<0,01
Видно, что в 1-й опытной группе, подвергавшейся максимальному ингаляционному воздействию ДМСО и ДМС, величина СПП достоверно выше уровню контроля (в 1,1 раза, p<0,01), что является признаком снижения возбудимости ЦНС. У животных 2-й, 3-й и 4-й опытных групп в этот срок подострого эксперимента значения СПП регистрировались достоверно ниже величины в 1-й опытной группе и не различались с контролем.
Полученное распределение величин СПП у подопытных животных подтверждает, что порог подострого ингаляционного действия смеси ДМСО и ДМС по влиянию на возбудимость ЦНС на 14-й день экспозиции близок к 16 величинам их гигиенических нормативов. Суммарные концентрации ДМСО и ДМС во 2, 3 и 4-й смесях, составляющие 6,9, 7,2 и 2,0 величин ОБУВ/ПДК, в стадии первичных реакций подострой интоксикации, в соответствии с зависимостью «концентрация-эффект», являются подпороговыми .
Из таблицы 3 видно, что на 28-й день экспозиции у животных 1-й опытной группы величины СПП существенно не отличались от значений в контроле, что объясняется формированием стадии адаптации подострой интоксикации .
Таблица 3 - Влияние смесей ДМСО и ДМС на возбудимость ЦНС и эмоционально-поведенческие реакции животных на 28-й день подострого эксперимента
Показатели | Группы подопытных животных | |||
1 группа | 2 группа | 3 группа | 4 группа | |
ГДА, у.е. | 23,3 ± 1,7 ** | 20,7 ± 0,9 ** | 25,3 ± 0,6 * | 30,5 ± 2,1 |
ВДА, у.е. | 3,3 ± 0,8 | 2,1 ± 0,7 | 2,3 ± 0,7 | 2,8 ± 1,5 |
ЭА, у.е. | 2,3 ± 0,4 | 1,5 ± 0,5 | 2,0 ± 0,6 | 2,0 ± 0,4 |
Груминг, у.е. | 11,3 ± 4,0 | 4,6 ± 1,5 | 9,0 ± 2,9 | 5,8 ± 2,6 |
СПП, В | 9,6 ± 0,4 | 8,7 ± 1,0 | 9,4 ± 0,6 | 9,0 ± 0,4 |
Примечание: М±m. ГДА – горизонтальная двигательная активность, ВДА – вертикальная двигательная активность, ЭА – эмоциональная активность, груминг – груминга реакции, СПП – суммационно-пороговый показатель; * – отличия от данных контрольной группы достоверны, p<0,05; ** – отличия от данных контрольной группы достоверны, p<0,01
У животных 2-й, 3-й и 4-й опытных групп в этот срок эксперимента статистических значимых различий с параллельным контролем в величинах СПП также не отмечалось (табл. 3). Нелинейный характер динамики изменения величин СПП в опытных группах в ходе 28-дневной экспозиции смесей ДМСО и ДМС представлен на рисунке 1.
Рисунок 1 - Динамика СПП у животных 1, 2, 3 и 4-й опытных групп (1, 2, 3, 4) и контрольной группы (К) в различные сроки подострого опыта
Рисунок 2 - Динамика средних величин горизонтальной двигательной активности у животных 1, 2, 3, 4-й опытных групп (1, 2, 3, 4) и контрольной группы (К) в различные сроки подострого опыта
Вместе с тем, на 28-й день экспозиции выявляется достоверное по отношению к уровню контроля снижение величин ГДА не только в 1-й, но и 2-й и 3-й опытных группах (табл. 3). Это свидетельствует о накоплении нейротоксического эффекта в результате 28-дневного ингаляционного воздействия смесей ДМСО и ДМС в суммарных концентрациях, близких к семи нормативным величинам . Статистическая обработка полученных данных показала отсутствие значимых различий в величинах ГДА во 2-й и 3-й опытных группах. Принимая во внимание сходные по силе эффекты воздействия 2-й и 3-я смесей, суммарные концентрации которых практически идентичны, двухкомпонентные смеси ДМСО и ДМС могут быть отнесены к смесям однородных веществ, к которым оправданно применение положения об изоаддитивности . В контексте токсикометрии, снижение величин ГДА во 2-й и 3-й опытных группах на 28-й день экспозиции указывает на функциональную кумуляцию ДМСО и ДМС, которая заключается в нарушении моторной функции ЦНС . Следствием накопления вредного эффекта является понижение порога нейротоксического действия двухкомпонентных смесей. Вместе с тем, оценка динамики величин ВДА, эмоциональной активности и груминга реакции в опытных группах на 14-й и 28-й день эксперимента достоверных различий с уровнями в контрольной группе не обнаружила, что указывает на парциальность нарушений функций ЦНС (табл. 2-3).
Анализ биохимических анализов крови крыс 1-й опытной группы, подвергающихся максимальной экспозиции ДМСО и ДМС, на 14-й день подострого опыта показал снижение (в 1,3 раза, р<0,01) активности АЛТ по отношению к уровню контроля (табл. 4).
Таблица 4 - Влияние смесей ДМСО и ДМС на концентрации в сыворотке крови животных мочевины, АЛТ, АСТ и соотношение АСТ/АЛТ на 14-й день подострого опыта
Группы животных | Величины показателей | |||
МН, ммоль/л | АЛТ, Е/л | АСТ, Е/л | АСТ/АЛТ, ед. | |
1-я опытная | 13,9±1,5 | 46,4±2,6 ** | 108,1±7,7 | 2,32±0,07 |
2-я опытная | 13,1±1,0 | 52,9±2,2 | 122,1±8,2 | 2,31±0,1 |
3-я опытная | 10,5±0,6 | 52,0±7,3 | 119,1±13,6 | 2,35±0,1 |
4-я опытная | 11,5±0,9 | 55,6±2,3 | 134,0±9,2 | 2,41±0,1 |
Контрольная | 10,5±0,9 | 60,0±3,3 | 125,6±8,4 | 2,12±0,1 |
Примечание: М±m. МН – мочевина крови, АЛТ – активность аланинаминотрансферазы, АСТ – активность аспартатаминотрансферазы, АСТ/АЛТ (соотношение активности АСТ/АЛТ, коэффициент де Ритиса); * – отличия от данных контрольной группы достоверны, p<0,05; ** – отличия от данных контрольной группы достоверны, p<0,01
При этом во 2-й, 3-й и 4-й опытных группах степень активности АЛТ существенно не отличалась от уровня контроля (табл. 4). Логично предположить, что ослабление активности АЛТ в результате ингаляционного воздействия 1-й смеси ДМСО и ДМС является признаком перестройки аминокислотного обмена, вызванной увеличением энерготрат экспонируемого организма . Это подтверждает напряжение механизмов, ответственных за развитие процесса адаптации биологической системы при экспозиции двухкомпонентной смеси ДМСО и ДМС в суммарной концентрации, близкой к порогу подострого действия . Анализ динамики активности в крови крыс 1-й опытной группы АЛТ на 28-й день экспозиции обнаружил её дальнейшее (1,5-кратное, р<0,05) снижение по отношению к уровню контроля (табл. 5).
Таблица 5 - Влияние смесей ДМСО и ДМС на концентрации в сыворотке крови животных мочевины, АЛТ, АСТ и соотношение АСТ/АЛТ на 28-й день подострого опыта
Группы животных | Величины показателей | |||
МН, ммоль/л | АЛТ, Е/л | АСТ, Е/л | АСТ/АЛТ, ед. | |
1-я опытная | 17,9±3,2 * | 41,6±7,1 * | 124,0±19,8 | 2,84±0,3 * |
2-я опытная | 14,7±1,5 | 62,6±3,3 | 154,9±8,1 | 2,48±0,08 ** |
3-я опытная | 13,4±0,7 | 43,4±3,8 | 98,4±8,2 | 2,30±0,1 |
4-я опытная | 9,06±1,2 | 53,6±5,3 | 127,8±10,5 | 2,14±0,3 |
Контрольная | 10,9±0,9 | 65,6±5,9 | 130,4±12,9 | 2,0±0,1 |
Примечание: М±m. МН – мочевина крови, АЛТ – активность аланинаминотрансферазы, АСТ – активность аспартатаминотрансферазы, АСТ/АЛТ (соотношение активности АСТ/АЛТ, коэффициент де Ритиса); * – отличия от данных контрольной группы достоверны, p<0,05; ** – отличия от данных контрольной группы достоверны, p<0,01
Анализ активности в сыворотке крови АСТ на 14-й и 28-й дни эксперимента не выявил статистически значимых различий в уровнях у крыс опытных и контрольной групп. Вместе с тем, на 28-й день подострого опыта отмечено увеличение значений соотношения АСТ/АЛТ в 1-й и 2-й опытных группах, достоверное по отношению к величине в контроле (соответственно, в 1,4 раза, р<0,05 и 1,2 раза, р<0,01). Увеличение коэффициента де Ритиса у крыс является значимым маркером активации процессов обмена аминокислот и глюконеогенеза . В этом контексте является закономерным увеличение содержания в крови крыс 1-й опытной группы мочевины (в 1,6 раза, р<0,05), подтверждающее усиление катаболических процессов. Графический анализ показал, что тенденция к изменению содержания мочевины в крови животных опытных групп носит дозозависимый характер, вместе с тем не достигающий уровня значимости во 2-й, 3-й и 4-й группах.
4. Обсуждение
В настоящее время постулируется, что изучение комбинированного токсического действия при совместном присутствии в атмосферном воздухе химических веществ, в том числе смесей постоянного состава, оправданно проводить на уровне и ниже максимальных недействующих концентраций отдельных компонентов . В связи с этим исследовалось комбинированное действие ДМСО и ДМС в 4-х концентрациях, являющихся, по данным литературы подпороговыми , . Принимая во внимание преимущественное действие на центральную нервную систему, ДМСО и ДМС рассматривались как токсикологически сходные вещества . Особенности экспериментальных проявлений нейротоксичности, состоящей в однотипном изменении у подопытных крыс показателей функционального состояния ЦНС, принимались за доказательства однородного действия, совпадение манифестированных эффектов смесей с идентичными суммарными значениями кратностей превышения нормативов — за однонаправленное (синергическое) действие . В качестве рабочей гипотезы принято предположение о том, что 2-я и 3-я смеси, имеющие примерно одинаковые суммарные значения кратностей превышения гигиенических нормативов в атмосферном воздухе ДМСО и ДМС, установленных соответственно на уровнях 0,1 и 0,08 мг/м3, являются качественно эквивалентными, компоненты которых взаимозаменяемы. В случае выявления различий в величинах эффектов, предполагалось введение коэффициента аддитивности К, определяющего величину отклонения от аддитивности: если К>1, то комбинированное действие является более чем аддитивным, если К<1 — менее чем аддитивным .
Сопоставление концентраций ДМСО и ДМС в 1-й смеси, равных соответственно 0,741±0,1 мг/м3 и 0,674±0,04 мг/м3, со справочными (литературными) сведениями о порогах их хронического изолированного действия, представленных на уровнях соответственно 120 мг/м3 и 26 мг/м3 , , давало основания полагать, что вредные эффекты от её воздействия могут возникать только в случае более чем аддитивного действия компонентов. Ещё в большей мере это предположение относится к концентрациям ДМСО и ДМС во 2-й, 3-й и 4-й смесях, установленных на уровнях существенно ниже порогов действия. Вместе с тем, снижение порога действия на заключительном этапе подострого опыта может определяться накоплением нейротоксического эффекта смесей ДМСО и ДМС, которое обозначается феноменом функциональной кумуляции . В таком случае, значимым подтверждением порогового и надпорогового уровней воздействия смесей является усиление катаболизма аминокислот и белков, за счёт которого обеспечиваются возрастающие энергетические потребности экспонируемого организма.
5. Заключение
Таким образом, изучение комбинированного токсического действия ДМСО и ДМС в условиях 28-дневной экспозиции белых крыс-самцов подтвердило нейротоксическое действие двухкомпонентных смесей и более чем аддитивное действие ДМСО и ДМС при совместном присутствии в воздушной среде в концентрациях, близких к недействующим. В контексте настоящего исследования, суммарное значение кратностей превышения гигиенических нормативов ДМСО и ДМС в атмосферном воздухе, приближающееся к 7, может рассматриваться в качестве предварительной оценки порога хронического действия целевых двухкомпонентных смесей. При указанном фактическом и прогнозном уровнях загрязнения атмосферного воздуха смесью ДМСО и ДМС целесообразно проведение исследования причинно-следственных связей между состоянием здоровья населения и воздействием аэрогенного химического фактора.
Установление специфичности связи между обозначенным химическим фактором и нарушениями возбудимости ЦНС, эмоционально-поведенческих реакций у подопытных животных относится к решающим условиям при переносе знания с модели на объект исследования, которым является общественное здоровье. Одновременно, обнаруженные изменения диагностических тестов, отражающие характер ответа модельного организма на подострое ингаляционное воздействие смесей ДМСО и ДМС, представляют значимость в качестве одного из критериев оценки опасности спектра их фактических концентраций в атмосферном воздухе селитебных зон горнопромышленных районов и могут служить основой разработки технологии ранней диагностики вредных для здоровья эффектов в экспонируемых контингентах населения.