1. Введение

Контаминация окружающей среды токсичными металлами (ТМ) и как следствие интоксикация ими населения – серьезная проблема индустриальных стран. Значительное внимание медиков и экологов привлечено к таким приоритетным персистентным неорганическим экотоксикантам как свинец, ртуть и кадмий, хотя и другие ТМ заявляют о себе время от времени и интерес к ним не пропадает. Острота этой проблемы в мире не уменьшается с годами, несмотря на предпринимаемые меры организационного, технологического и медицинского характера; токсическое действие ТМ на здоровье населения и загрязнение этими металлами окружающей среды актуально и для Российской Федерации. Государство, в принципе, обеспокоено этой ситуацией и прилагает меры для защиты населения от негативного воздействия ТМ, о чем свидетельствует ФЗ № 52-ФЗ от 30.03.1999 «О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения». В 2009 году постановлением Правительства № 791 от 27 октября 2008 года впервые была утверждена Федеральная целевая программа «Национальная система обеспечения химической и биологической безопасности Российской Федерации», которая действовала до 2020 года [1]. Во исполнение Указа Президента Российской Федерации № 97 от 11.03.2019 «Об Основах государственной политики Российской Федерации в области обеспечения химической и биологической безопасности на период до 2025 года и дальнейшую перспективу» постановлением Правительства Российской Федерации утверждена государственная программа «Обеспечение химической и биологической безопасности Российской Федерации» на период 2021-2030 годы. Важным направлением этой программы является контроль содержания токсикантов в объектах окружающей среды и биосредах человека. Примечательно, что в ст. 1 Федерального закона № 102-ФЗ от 26.06.2008 «Об обеспечении единства измерений», регламентирующем аналитическую сторону указанного контроля, в первую очередь указано, что сфера государственного регулирования обеспечения единства измерений в частности распространяется на измерения, которые выполняются при:

– обеспечении пожарной безопасности, безопасности людей на водных объектах;

– выполнении работ по обеспечению безопасных условий и охраны труда;

– осуществлении деятельности в области здравоохранения;

– осуществлении ветеринарной деятельности;

– осуществлении деятельности в области охраны окружающей среды;

– осуществлении деятельности в области гражданской обороны, защиты населения и территорий от чрезвычайных ситуаций природного и техногенного характера [2].

Этот же закон определяет понятия «средство измерений» и «стандартный образец» (СО) и декларирует, что в сфере государственного регулирования обеспечения единства измерений применяются стандартные образцы утвержденных типов [3]. Классификация, общие требования к стандартным образцам, их разработке, испытаниям, утверждению (признанию) и применению закреплены ГОСТ Р 8.753-2011 «Стандартные образцы материалов (веществ)». Таким образом, в системе законодательных актов Российской Федерации прослеживается и устанавливается государственная важность СО в части защиты здоровья населения от действия ТМ и охраны окружающей среды [4].

Цель исследования: разработка технологий создания референтных материалов (РМ) состава биологических сред, содержащих ТМ и их государственная аттестация как СО состава биологических сред, содержащих токсичные металлы.

2. Методы и принципы исследования

Биосредами, на основе которых велась разработка РМ, содержащих ТМ и соответствующих СО были основные диагностические среды – кровь и моча. Мочу получали от белых беспородных крыс самцов путем их высаживания в обменные клетки на время достаточное для получения нужного объема мочи, до 48-ми часов.

Для изготовления РМ состава крови была опробована донорская кровь, бычья кровь, кровь кроликов и крыс. Крыс и кроликов приобретали в Федеральном государственном унитарном предприятии «Питомник лабораторных животных «Рапполово» Национального исследовательского центра «Курчатовский институт». Содержание животных соответствовало ветеринарным нормативам и требованиям ГОСТ 33044-2014 от 01.08.2015 «Принципы надлежащей лабораторной практики»; для кормления использовали кормосмесь К-58 по ТУ 9296-00101538658-95, для питья – водопроводную воду. Бычью кровь приобретали в племзаводе «Лесное».

Свежие кровь и мочу фильтровали через синтетическую сетку с ячейкой не более 1 мм2. В кровь для предотвращения ее свертывания добавляли раствор гепарина. Небольшой объем работы выполнен с применением человеческой донорской крови, которую приобретали на Станции переливания крови Санкт-Петербурга. Но от этого биоматериала пришлось по ряду причин отказаться, главная из которых – санитарно-гигиенические ограничения на работу с потенциально инфицированными материалами [5].

Определение содержания металлов в биосредах производили тем или иным методом в зависимости от конкретной задачи эксперимента и в соответствии с методиками на анализаторы металлов – инверсионная вольтамперометрия (анализатор АВА-3; РФ, Санкт-Петербург, НПП «Буревестник»), атомно-абсорбционная спектрометрия (анализаторы МГА -915, РФ, Санкт-Петербург, ГК «Люмекс»), масс-спектрометрия с индуктивно связанной плазмой, эмиссионная спектрометрия с индуктивно связанной плазмой (анализатор Plasma Quant MS Elite, Analitik Jena GmbH) [6], [7].

Для определения ртути в биосредах был разработан и запатентован метод прямого определения металла на анализаторе ртути РА-915 (RU 2696958).

В качестве источников ТМ для интоксикации животных использованы водорастворимые ацетатные соли соответствующих металлов квалификации х.ч. – в режиме in vivo, или аттестованные СО водных растворов ТМ – в режиме экспериментов in vitro.

Статистическая обработка результатов измерений выполнена с помощью программы Biostat [8].

Метрологическая аттестация референтных материалов на присвоение типов СО осуществлялась совместно с ФГУП УНИИМ.

Животных содержали в соответствии с требованиями ГОСТ 33044-2014 от 01.08.2015 г. – «Принципы надлежащей лабораторной практики». Исследования соответствовали принципам гуманности, изложенным в Директиве 2010/63/ЕU Европейского парламента и Совета Европейского Союза по охране животных, используемых в научных целях. Работа контролировалась комиссией по биоэтике ФГБУ НКЦТ им. С.Н. Голикова ФМБА России.

3. Основные результаты

Цель исследований была обусловленная разработкой технологии получения референтных материалов РМ состава крови и/или мочи, как материальной основы СО. В первых наработках РМ была использована бычья кровь, в которой растворяли известное количество нитрата свинца, так называемая – технология in vitro. СО, изготовленные из такого РМ, имели недопустимо большой разброс в величине концентрации аналита в конечном продукте, наблюдалась неудовлетворительная сходимость результатов, полученных на различных анализаторах, различными методами анализа (см. таблицу 1).

Причиной могло быть неравномерное распределение свинца, как по объему, так и по форменным элементам крови. В дополнение, технология не является достаточно унифицированной, не предполагает получение РМ нежидких тканей, например, мышечной ткани, ткани печени, почек, в матрицу которых этим способом не удастся инкорпорировать металл.

Предпочтение в последующих разработках было отдано методам in vivo, при которых ТМ инкорпорируется в матрицу биосреды естественным, метаболическим путем. Продукты, полученные таким способом, могут считаться самыми адекватными в качестве СО, они могут быть применимы при любых соответствующих методах анализа и пробоподготовки. Была поставлена задача разработать удобную в применении и рациональную по затратам технологию введения ТМ в биосреды животного и получения необходимых биоматериалов.

Первый опыт решения этой задачи заключался в алиментарной интоксикации животных растворимыми солями ТМ. Были опробованы нитратные и ацетатные соли свинца, ртути, кадмия, которые добавляли в питьевую воду при содержании крыс в условиях вивария. Схема подобного эксперимента со свинцом, например, выглядела следующим образом.

Подобранных по весу животных группами по 5-6 особей высаживали в клетки со свободным доступом к корму и питьевой воде. Ежедневно в течение тридцати суток контролировали общую массу животных и объем выпитой воды. При расчетной дозе свинца, в частности, 32 мг/кг на последний день эксперимента фактическая доза интоксикации составила 31,3±1,87 см3 (n=24), что вполне соответствовало задаче эксперимента. Подбирая опытным путем концентрации ТМ в питьевой воде и сроки выдерживания животных в таких условиях алиментарной интоксикации, добивались нужных концентраций ТМ в биосредах животного. Все испытанные дозы оказались щадящими для здоровья подопытных крыс, и они благополучно жили длительное время по окончании эксперимента. Сложность в применении этой технологии пероральной интоксикации животных состояла в том, что между дозой интоксикации и содержанием металла в крови не существовало линейной зависимости (см. рисунок 1).

Несмотря на то, что такой подход давал приемлемые результаты и решал поставленную задачу, необходимость ежедневных взвешиваний животных и контроля водопотребления делали такую технологию достаточно хлопотной и затратной. Некоторым недостатком при определенных требованиях являлась невозможность достичь высоких концентраций металлов биосредах, т.к. животные отказывались пить воду с высоким содержанием ТМ (см. рисунок 1).

Следующим шагом в развитии технологии получения РМ необходимого состава и концентрации ТМ в биосредах стала парентеральная интоксикация водорастворимыми солями ТМ. Выбор между внутрибрюшинным и внутримышечным введением был сделан в пользу последнего, как дающего более стабильный результат, более определенно прослеживалась связь между дозой и концентрацией ТМ в крови и моче. Чтобы добиться лучшей переносимости животными введения ТМ, снизить концентрацию вводимой ацетатной соли металлов, применили распределенную дозу – введение делали трижды в начале эксперимента, поочередно в мышцы задней левой и правой лапы животного.

В экспериментах по изучению динамики накопления свинца, ртути и кадмия, испытаниях различных доз этих металлов было установлено что, оптимальными концентрациями этих металлов будут 45 мг/кг, 0,5 мг/кг и 3,0 мг/кг, соответственно. Отбор крови и мочи следует производить в период максимального содержания ТМ в биосредах, с 5-го по 10-й день после последнего, третьего введения токсиканта.

Значительная часть исследований была выполнена на крысах, но в последних разработках были также была использована кровь кроликов. Соотношение цены крыса/кролик примерно ¼, но по выходу биоматериала (крови) от этих животных соотношение обратное, примерно 10/1, т.е. кролики как минимум в 2,5 раза рентабельнее крыс. По реологическим свойствам кровь кроликов более походит на человеческую, к тому же она не так легко сворачивается как крысиная кровь.

При сотрудничестве с Уральским научно-исследовательским институтом метрологии (УНИИМ) была проведена метрологическая аттестация некоторых разработанных во ФГБУ НКЦТ им. Голикова ФМБА России продуктов и получены свидетельства на типы СО – ГСО, МСО. Эти СО изготовлены в виде лиофилизатов соответствующих биосред и помещены в герметично закрытые пенициллиновые флаконы объемом 15 см3. Аттестованные СО снабжены паспортом с номером типа, номером партии и датой изготовления. Согласно инструкции по применению, во флаконы с лиофилизатом добавляют указанные объемы воды, получая таким образом продукт, годный для аналитического использования. В конкретной партии может быть несколько флаконов, отличающихся концентрацией аналита, чтобы иметь возможность охватить широкий диапазон концентраций металла в опытном материале. В таблице 2 приведены типы аттестованных СО и концентрации металлов в них.

Изготовленный на основе донорской (человеческой) крови СО – (BL-Me) ГСО 9940-2011, Свидетельство № 2228 от 26.10.2011. был изготовлен только в виде опытных образцов, срок годности его свидетельства истек и не продлевается. 

Одна из мировых тенденций в разработке СО состоит в создании мультэлементных продуктов, т.е. содержащих одновременно несколько ТМ. Это особенно актуально в связи с появлением новых методов анализа металлов – ICP-MS и ICP-AES, позволяющих без перенастроек аппаратуры, практически одномоментно определять несколько металлов в пробе. Первые попытки создать отечественный мультиэлементный СО (референтный материал) состава крови содержащей свинец, ртуть и кадмий были выполнены из крови кроликов, путем одновременной интоксикации животного ацетатными солями свинца, ртути и кадмия. Несмотря на то, что такой подход можно было бы считать наиболее адекватным реальным условиям интоксикации, он не оправдал себя. Во-первых, кролики, с трудом переносили одномоментное введение трех токсичных металлов. Во-вторых, концентрация металлов в крови животного неопределенно зависел от дозы. В-третьих, наблюдались конкурентные отношения между металлами, увеличение дозы одного ТМ, изменяло содержание в крови других, что делало результаты интоксикации еще более неопределенными. Ввиду этих трудностей посчитали целесообразным создавать мультиэлементные СО на основе моноэлементных референтных материалов. Была разработана и запатентована [9].унифицированная технология получения мультиэлементных референтных биоматериалов жидких биосред широкого концентрационного диапазона и состава металлов, суть которой состояла в следующем.

Если обозначить как:

– СPb, СHg и СCd – концентрации свинца, ртути и кадмия в банках моноэлементной мочи (мкг/дм3);

– VPb, VHg и VCd – объемы моноэлементной мочи, необходимые для получения банка композитной мочи (см3);

– n – необходимое количество мультиэлементных образцов;

– v ­– объем мочи в мультиэлементном образце (см3);

– сPb, сHg и сCd – концентрация свинца, ртути и кадмия в образце композитной мочи мультиэментного состава (мкг/дм3),

то для приготовления n образцов мультиэлементной мочи объемом v с содержанием свинца, ртути и кадмия сPb, сHg и сCd необходимо взять следующие объемы моноэлементной мочи:

Смешивая согласно уравнениям (1), (2) и (3), объемы моноэлементной мочи VPb VHg и VCd, получают объем композитной мочи:

Расфасованную по n флаконам композитную мочу подвергают лиофилизации, получая сухой остаток – референтный материал, имеющий необходимую массу свинца, ртути и кадмия. Это продукт при растворении в воде объемом v, по сути, после метрологической аттестации, является СО состава мочи, содержащей необходимые концентрации свинца, ртути и кадмия. Предлагаемая технология может быть применена к другим жидким биосредам – кровь, плазма крови, она при разработке соответствующей НИР оформлена в виде лабораторного регламента.

В конкретной разработке мультиэлементного рефернтного материала состава мочи, содержащей свинец, ртуть и кадмий на первой стадии были созданы три банка моноэлементной мочи: свинец – 649,2±7,1 мкг/дм3, кадмий – 29,8±0,44 мкг/дм3, ртуть – 84,2 ±1,1мкг/дм3. Второй задачей этой разработки было получение 10-ти образцов композитной мочи по 4 см3 со следующими ориентировочными концентрациями свинца, ртути и кадмия – 600 мкг/дм3, 60 мкг/дм3 и 30 мкг/дм3 , соответственно.

Согласно уравнениям (1), (2) и (3), имеем:

Тщательно смешав рассчитанные объемы моноэлементной мочи, получили 105,8 см3 композитной мочи, которую расфасовали по 10,58 см3 в 10 флаконов и подвергли лиофилизации. Получаемый после лиофилизации продукт является мультиэлементным референтным материалом состава мочи, содержащей свинец, ртуть и кадмий. При добавлении во флакон 4 см3 дистилированной воды и растворении лиофилизата, получают мочу с указанными концентрациями свинца, ртути и кадмия, готовую для аналитического применения [10].

Предложенный методический подход позволил при сохранении естественной матрицы биосреды разработать унифицированную технологию изготовления мультиэлементных РМ широкого концентрационного диапазона металлов различного состава жидких биологических материалов.

4. Обсуждение

Первые сертифицированные материалы состава биологических сред, содержащие металлы появились и стали применяться в середине прошлого века. Наибольших успехов в этом деле достигли США, Великобритания и некоторые объединившиеся страны Европы, создавшие единый центр изготовления и сертификации СО. Американский NIST (National Institute of Standards and Technology), безусловно, является мировым лидером в разработке и применению СО, в частности SRM и CRM для медико-биологических исследований. Производителями сертифицированных референтных материалов являются Япония, Китай, некоторые страны Латинской Америки. За рубежом производятся и используются СО самого широкого состава биологических сред – кровь, плазма крови, грудное молоко, моча, ткани печени, мышечные ткани млекопитающих и рыб, тканей почек, волосяного  покрова [15], [16], [17].

Разработки ФГБУ НКЦТ им. С.Н. Голикова ФМБА России по технологии изготовления РМ и утвержденные типы СО позволяют отечественной медико-биологической аналитике металлов подняться на современный уровень исследований содержания металлов в биосредах [18]. Запатентованы оригинальные технологические решения, получены продукты, аттестованные на государственном уровне. На основе разработанных технологий могут быть получены рефернтные материалы как необходимого состава биосред, так и содержащих широкий спектр металлов. Проблема реального масштабного производства и применения СО в стране состоит в заинтересованности таких ведомств как РАН, Минздрав, Минобрнауки, Минсельхоз, Минпромторг, Минпродтор, в продолжении финансирования этого направления исследований, товарном производстве и реальном применении СО. Рано или поздно это придется сделать [19], [20], [21], [22]. Наличие таких продуктов это не столько поддержание авторитета страны в области медико-биологической аналитики, сколько реальная проблема качества научно-прикладных исследований [23].

Учитывая масштабы нашей страны и номинальную потребность в аттестованных контрольно-измерительных материалах, рост контаминированности окружающей среды ТМ, а также развитие сети коммерческих медицинских центров, практические результаты разработок СО имеют также серьезный коммерческий потенциал [24].

5. Заключение

В результате экспериментальных исследований разработаны оригинальные технологии по созданию референтных материалов диагностических биосред, содержащих приоритетные неорганические экотоксиканты – ТМ. Эти технологии позволили аттестовать на высоком государственном уровне СО состава крови, содержащие свинец, ртуть, кадмий и другие металлы, создать методическую основу для изготовления СО широкого концентрационного диапазона и состава металлов.

The additional file for this article can be found as follows: