1. Введение

В практике экспериментальной токсикологии, в том числе при выполнении исследований на животных с целью обоснования гигиенического норматива в воздухе рабочей зоны, установлении нормативных требований к концентрации веществ для оценки профессиональных рисков здоровью работников, фармакологических исследованиях, в медицине для ряда нозологических форм патологий особое значение имеет изучение ингаляционной токсичности химических веществ при различных уровнях и времени экспозиции животных. Для моделирования ингаляционного воздействия химического вещества на лабораторных животных существуют несколько методических способов экспонирования животных (интраназально — введение в полость носа, эндотрахеально — минуя верхние дыхательные пути, ингаляционно — только через нос или только через голову, либо путем воздействия на всю поверхность тела в затравочных камерах). Оптимального способа для изучения ингаляционной токсичности, который можно считать универсальным и подходящим для большинства целей эксперимента на сегодня не существует. При выборе способа моделирования ингаляционного воздействия на животных на стадии планирования эксперимента необходимо исходить из конкретных целей и задач, которые стоят перед экспериментатором, возможностей, преимуществ и недостатков каждого конкретного способа, материально-технических условий и квалификации персонала лаборатории. Многообразие аспектов ингаляционного воздействия и последующих токсических эффектов, вызванных системным и/или локализованным воздействием химического вещества/наночастиц, представляется одной из основных методологических проблем, которая является препятствием для развития альтернативных подходов к тестированию, например на моделях in vitro [1], [3], [4], [6].

Цель исследования

— дать краткое описание и провести сравнительный анализ методических особенностей, свойственных различным способам моделирования ингаляционной экспозиции в практике токсикологического эксперимента на животных, охарактеризовать основные альтернативные методы (in vitro и in silico).

2. Основная часть

Одним из способов введения веществ, который моделирует ингаляционное поступление является интраназальный, подходящий для решения определенных задач в токсикологии, также нашедший свое применение в доклинических испытаниях безопасности при выводе на рынок фармацевтических препаратов (изучение фармакодинамики и их доклиническая токсикологическая оценка), в исследованиях на животных с целью индукции патологий, например воспроизведении и изучении инфекции верхних или нижних дыхательных путей. В научной и инструктивно-методической литературе подробно описана техника и устройства для интраназального введения лабораторным животным, концентрации и режим дозирования изучаемого вещества, пересчет вводимых доз на ингалируемые концентрации, частота и кратность введения, учет размеров частиц, химических свойств и состава, необходимые манипуляции и возможные затруднения с точки зрения соблюдения принципов гуманности при обращении с животными [6], [8], [9], [11].

Таким образом, основными преимуществами при выборе интраназального способа моделирования ингаляционного воздействия является следующие характеристики:

– неинвазивный метод;

– не требуется дорогостоящего оборудования, простые устройства для введения — пипетки, дозаторы, катетеры без иглы, шприц Гамильтона;

– точность в дозировании;

Наиболее характерные недостатки:

– не соответствует реальному способу экспозиции;

– расчетная доза часто больше по объему, чем может вместить носовой ход, из-за этого введение может быть повторным, дробным или многократным, что может причинять страдания животным;

– необходимо учитывать анатомические различия в строении носовых ходов у разных видов животных;

– не вся доза химического вещества достигает легких, потому что часть может заглатываться в пищевод, оставаться в верхних отделах легких.

Эндо-(интра)трахеальный способ введения химических веществ является альтернативной моделью по отношению к исследованиям в затравочной камере, т.к. может быть осуществлен при отсутствии специальной ингаляционной техники. Кроме того, этот способ позволяет осуществлять доставку вещества непосредственно в легкие, когда создается возможность избежать заглатывания вещества в пищевод. Однако данный метод введения, используемый для суспензий или относительно крупнодисперсных аэрозолей, не в полной мере отражает естественный процесс поступления веществ в организм. Кроме того, эндотрахеальное введение является инвазивным методом, в определенной степени травмоопасным для животного, требует определенных технических навыков и опыта, которые должны подтверждаться соответствующей подготовкой персонала, требует подбора и применения специальных инструментов (эндотрахеальных зондов, катетеров) для разных видов животных [3], [6], [12], [14].

Способ исследований с применением специальной затравочных камер двух типов — только через нос или только через голову, либо путем воздействия на всю поверхность тела в камерах имеет несколько безусловных достоинств. Наиболее близко отражает естественный процесс поступления веществ в организм через органы дыхания, когда животные подвергаются воздействию исследуемого вещества в виде газа, пара, аэрозоля или их смеси. Способ рекомендован в качестве основного метода изучения ингаляционной токсичности Организацией экономического сотрудничества и развития (OECD), протоколы исследований которой являются наиболее релевантными для использования в токсикологической и фармакологической практике, приняты и утверждены как стандарты надлежащей лабораторной практики (GLP). Последний пересмотр рекомендаций OECD включил требования по проведению испытаний аэрозольных наночастиц в связи с актуальностью исследования токсичности наноматериалов. Также последняя редакция предусматривает выполнение бронхоальвеолярного лаважа и изучения лаважной жидкости для всех исследуемых химических веществ, дополнительно для труднорастворимых в воде частиц предусмотрено измерение нагрузки на легкие [15], [16], [17], [18].

Предпочтительным способом ингаляционной затравки является камера с ингаляцией только через нос (включая проникновение только через голову, только через нос или только через морду) по следующим причинам [18], [19]:

– позволяют учитывать физико-химические свойства изучаемых веществ (например, для жидких и/или твердых аэрозолей, а также паров рекомендуется использовать способ воздействия в камере через нос, что обусловлено способностью аэрозолей и паров конденсироваться на стенках камеры для всего тела, в сравненении с тем, когда вещество поступает непосредственно через нос).

– воздействие и/или попадание в организм любым другим путем, кроме ингаляции (пероральный путь через кожу или кожный путь), сводятся к минимуму, особенно при тестировании аэрозолей;

– воздействие на техников при работе с животными сведено к минимуму;

– требуется минимальное количество исследуемого химического вещества из-за малого объема камеры;

– легко достигаются высокие концентрации (например, предельные концентрации для классификации по международным критериям и стандартам);

– время, необходимое для достижения равновесия в ингаляционной камере, незначительно по сравнению с продолжительностью воздействия и, следовательно, не является проблемой;

– воздействие на отдельных животных может быть прервано в любое время в течение курса воздействия, чтобы избежать чрезмерных страданий животных;

– животные легко доступны для проведения специфических физиологических измерений (например, функции дыхания, температуры тела) или, при необходимости, для взятия крови.

– предварительная подготовка воздуха перед его подачей в ингаляционную камеру (например, для удаления повсеместно встречающихся в окружающей среде компонентов, таких как озон, оксиды азота, углеводороды и твердые частицы, или для проведения испытаний в заданных условиях влажности или газового состава) технически менее сложна для камер, предназначенных только для носа, чем для более крупных ингаляционных камер для всего тела.

Для способа моделирования ингаляционного воздействия с помощью ингаляционных (затравочных) камер можно выделить и ряд недостатков, связанных со сложностями при подборе оптимальных параметров экспозиции для достижения целевых концентраций исходя из физико-химических особенностей конкретного вещества (необходимость индивидуальной калибровки анализаторов концентраций, подбора скорости воздушных потоков, правильного дозирования химических веществ, контроля влажности и температуры внутри экспозиционного блока), высокая стоимость затравочных камер.

В качестве альтернативы исследованиям ингаляционной токсичности на животных крупные международные научные организации разрабатывают модели in vitro. Так, на сегодня можно выделить две тест-системы — 3D-модель мукоцилиарной ткани (EpiAirway™) и модель ткани первичных трахеобронхиальных эпителиальных клеток человека, имеющих in vivo подобную структуру и функции. Эти тест-системы как и другие клеточные методы (например, клеточная линия альвеолярного эпителия человека (А549) продолжают совершенствоваться, однако их применение носит ограниченный характер и связано с необходимостью параллельных экспериментов in vivo. Как и многие другие альтернативные методы, тест-системы изучения ингаляционной токсичности in vitro должны быть валидированы и стандартизованы на международном уровне. Большинство разрабатываемых в обозримом будущем и существующих моделей in vitro имеют ограничения, так как, например, не позволяют объективно смоделировать долговременная задержку (накопление) частиц в организме при хронической ингаляционной экспозиции [20], [21].

Двухмерные клеточные модели (2D) не воспроизводят микроокружение клеток, трехмерные клеточные конструкции (3D) позволяют воссоздать более реалистичную биохимическую и биомеханическую микросреду ткани или органа, включая межклеточные взаимодействия, пространственно-временное распределение питательных веществ, кислорода и конечных продуктов метаболизма. Однако для моделирования функции легочных ацинусов (терминальная бронхиола с богато васкулизированными альвеолами) 2D и/или 3D модели in vitro-модели не позволяют воспроизвести и оценить растяжимость альвеолярных структур, критически важного параметра для биомеханики легких. С целью наиболее реалистичного воспроизведения многоклеточной микроархитектуры, микросреды и моделирования основных физиологических функций альвеол учеными было создано микрофлюидное устройство, имитирующее не только структуру но и функцию органа — «легкое-на чипе» (от англ. Lung-on-a-Chip, LoC). Устройство LoC включает полимерный носитель/основу, на котором расположены клеточные элементы альвеолы и система жидкостных и газовых микроканалов, разделённых полупроницаемой эластичной мембраной из полидиметилсилоксана. Со стороны газового канала на мембране культивируются альвеолоциты, образуя границу раздела воздух–жидкость так, как это происходит в альвеоле. Со стороны жидкостных микроканалов мембрана засевается эндотелиоцитами и перфузируется культуральной жидкостью, имитируя микроциркуляторную сеть капилляров, в то время как дополнительные боковые вакуумные каналы имитируют дыхательные движения. Технология LoC имеет перспективы практического применения и может быть имплементирована как в фундаментальных, так и прикладных исследованиях. К примеру, микрофлюидный лёгочный чип был использован группой китайских исследователей по изучению связи полистирольного нанопластика с патогенезом хронической обструктивной болезни лёгких. Было показано, что жизнеспособность клеток значительно снижалась по мере увеличения концентрации полистирольного нанопластика, в то время как уровни трансэпителиального/трансэндотелиального электрического сопротивления снижались, а проницаемость альвеолярно-капиллярного барьера увеличивалась. К сожалению, микрофлюидные технологии не лишены недостатков, связанных с низкой стабильностью и воспроизводимостью, а также ограниченным диапазоном жесткости носителей и мембран. Среди основных проблем практического использования «органов-на-чипе» можно отметить отсутствие нормативной базы их применения, в том числе методов стандартизации и валидации моделей [22], [23], [24].

Перспективным направлением является развитие математического моделирования для прогнозирования токсикологических рисков, связанных с реальными экспозициями человека (методы in silico) [25].

В медицине уже известны и широко применяются современные возможности цифрового проектирования и визуализации объемных объектов. На сегодня с помощью компьютерного/математического моделирования создана трехмерная модель легкого — цифровая, объемная копия легкого, позволяющая не только визуализировать анатомические особенности строения, но и моделировать его функции, процессы (дыхания, кровотока) через уравнения и алгоритмы, что позволяет изучать структуру, предсказывать развитие болезней, тестировать лекарства и хирургические методы лечения, то есть, по сути, это объединение визуального представления с аналитическим описанием [25], [26]. Существуют и другие математические, пространственные модели легкого, которые находят применение для определенных целей. С учетом бурного развития сферы цифровых технологий, машинного обучения и искусственного интеллекта предполагается дальнейшее усовершенствование и интегрирование в токсикологическую методологию приемов математического моделирования.

3. Заключение

Одного оптимального способа для изучения ингаляционной токсичности, который можно считать универсальным и подходящим для большинства целей эксперимента на сегодня не существует. Выбор определенной модели для эксперимента должен быть объективно обоснован в каждом отдельном случае. В странах OECD большинство исследований ингаляционной токсичности, несмотря на сложность моделирования выполняется в затравочных камерах, т.к. данный способ наиболее близко отражает естественный процесс поступления веществ в организм через органы дыхания.

В качестве альтернативных методов разрабатываются клеточные методы in vitro, которые не прошли процедуры валидации и утверждения регуляторными органами, поэтому в ближайшее время не следует ждать полной замены и отказа от исследований на животных. С целью наиболее реалистичного воспроизведения многоклеточной микроархитектуры, микросреды и моделирования основных физиологических функций альвеол учеными было создано микрофлюидное устройство, имитирующее не только и функцию органа — «легкое-на-чипе» (от англ. Lung-on-a-Chip, LoC). Дальнейшее усовершенствование микрофлюидного лёгочного чипа является перспективным научным направлением, которое позволит изучать патофизиологию гематоальвеолярного барьера, молекулярные и клеточные особенности заболеваний альвеолы, а также проводить эффективный скрининг фармакологических препаратов, повышая таким образом общую эффективность, достоверность и экономическую целесообразность доклинических исследований

Перспективным направлением является развитие математического моделирования для прогнозирования рисков, связанных с реальными экспозициями человека и воспроизведения патологических процессов в легких. К настоящему времени разработаны и реализованы ряд математических моделей (вычислительных алгоритмов). Эти модели не смогли полностью заменить эксперимент на животных, но успешно используются при разработке методов диагностики и лечения заболеваний бронхоальвеолярной системы, что позволяет изучать структуру, предсказывать развитие болезней, тестировать лекарства и усовершенствовать хирургические методы лечения, также применимы в гигиенических исследованиях для задач оценки риска здоровью при ингаляторной экспозиции химических веществ.

The additional file for this article can be found as follows: