Применение рекомбинантных белков SARS-CoV-2 для одновременного выявления антител класса G к отдельным антигенам возбудителя инфекции COVID-19

Одной из наиболее эффективных мер противодействия пандемии, вызванной новой коронавирусной инфекцией является вакцинация населения

Для профилактики COVID-19 в России наиболее широкое применение нашли вакцины «Гам-КОВИД-Вак» (Спутник V), производства НИЦ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи и «ЭпиВакКорона» (ЭВК), производства ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора, которые вызывают выработку антител к разным белкам SARS-CoV-2. Спутник V создан на основе вектора аденовируса человека, в геном которого методами генной инженерии вставлен ген S-белка коронавируса, на который в организме привитого вырабатываются нейтрализующие вирус антитела

Наиболее просто оценить эффективность вакцинации можно по состоянию гуморального иммунитета – наличию в крови пациента специфических антител к доминантным антигенам вакцины. Наиболее популярным методом в настоящее время является иммуноферментный анализ (ИФА), выполняемый в планшетах для иммунологических реакций. Недостатком ИФА является его моноспецифичность, поэтому для оценки каждой вакцины должен быть создан отдельный диагностический набор. Другим подходом является совместное выявление антител к ряду доминантных антигенов разных вакцин. Ранее мы сообщали о разработке мультиплексного теста для оценки иммунитета к нескольким детским вакциноуправляемым инфекциям

Целью настоящей работы являлось исследование эффективности применения рекомбинантных белков коронавируса SARS-CoV-2 при разработке экспериментального диагностического теста для одновременного дифференцированного выявления антител класса G к отдельным антигенам возбудителя инфекции COVID-19 у переболевших и вакцинированных.

Материалы: азид натрия, казеин, мышиные моноклональные антитела к Fc фрагменту IgG человека (клон 600), пептон, сахарозу и твин-20 (Sigma-Aldrich, США); химические реактивы отечественного производства с квалификацией не ниже «чда»; иммуноглобулин класса G человека (Имтек, Россия). Для изготовления подложки аналитических матриц применяли синтетическую бумагу на основе поливинилхлорида «Pentaprint» марки PR-M180/09-07/9400 (Klöckner Pentaplast, Германия).

Иммунореагенты. Рекомбинантные белки N и RBD были получены в лаборатории иммунохимии ФБУН ГНЦ ВБ Вектор.

Получение рекомбинантного белка RBD.

Нуклеотидную последовательность, кодирующую фрагмент спайкового белка SARS-CoV-2 (участок 308V – 542N), получали путем синтеза (ООО ДНК-синтез, Россия), на основе штамма Wuhan-Hu-1 (GenBank: MN908947). Культуру-продуцент RBD получали в клеточной линии яичников китайского хомячка СНО-K1. Очистку проводили с помощью металл-хелатной аффинной хроматографии с использованием сорбента Ni-IMAC сефарозы (GE Helthcare, США)

Получение рекомбинантного белка N.

Синтез последовательности, кодирующей капсидный белок N SARS-CoV-2, штамма Wuhan-Hu-1 (GenBank: MN908947), проводился в ООО ДНК-синтез, Россия. Для амплификации фрагмента ДНК из исходной матрицы использовали праймеры CoVN-F (5'-aaaaaaggatcctctgataatggacccccaaaatcagc-3') и CoVN-R (5'-aaaaaagcggccgcggcctgagttgagtcagca-3'). Амплифицированный фрагмент клонировали в вектор экспрессии pET21. Для дальнейшей наработки белка клетки E. coli штамм BL21(DE3) трансформировали полученным вектором. Очистку проводили по аналогии с белком RBD

Комплекс антигенов из состава вакцин «ЭВК» предоставлен разработчиками вакцины.

Образцы. Исследования выполняли с использованием массива сывороток крови включающих: 35 образцов от пациентов вакцинированных «ЭВК»; 17 образцов пациентов привитых вакциной «Спутник V»; 13 образцов от людей, переболевших COVID-19, и 15 негативных образцов, полученных от доноров и пациентов с разной патологией в период до 2019 г. Массив предоставлен ООО «ИМБИАН» и содержит образцы сывороток (плазмы) крови человека, полученные у пациентов в медицинских учреждениях г. Новосибирска с соблюдением всех этических норм. Все переданные образцы обезличены, а информация о них анонимна.

Тесты сравнения. В качестве тестов сравнения использовали коммерческие наборы для ИФА: «SARS-CoV-2-IgG-Вектор» (РЗН 2020/12952), производства ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор», Россия и «SARS-CoV-2 IgG RBD-ИМБИАН-ИФА» (РЗН 2021/13925), производства ООО «ИМБИАН», Россия.

Экспериментальный набор. Набор «SARS-CoV-2-спектр-IgG» включает в себя четыре аналитические ванны, четыре блока белковых матриц, флакон 1 с очищенной водой и флакон 2 с жидким компонентом проявляющей системы (0,4% раствор азотнокислого серебра в очищенной воде), объёмом по 4,2 мл. Набор полностью автономен и может быть использован для тестирования 20 образцов. Общий вид набора приведен на рисунке 1с. Аналитические матрицы представлены в виде блоков (гребней) с 5 зубцами, каждый из которых рассчитан на одно исследование. На каждую матрицу аликвотами по 2,0 мкл наносили реагенты захвата и два положительных контроля – IgG Hum (Control1+) и коллоидное золото (Au-Control+), разведенные в 0,005 М боратном буферном растворе (рН 6,0) до концентрации 10 мкг/мл. Схема расположения реагентов захвата приведена на рисунке 1b. Блоки высушивали в течение 10 ч при 25 оС, блокировали 1 ч в 0,2%-м растворе казеина, тщательно просушивали, упаковывали в фольгированные пакеты и хранили до использования при 4 оС.

Полипропиленовые аналитические ванны, рассчитаны на проведение 5 анализов и состоят из 12 рядов по 5 ячеек в каждом. Ванны заполняли готовыми к применению рабочими растворами по схеме: ряд 1 – раствор для разведения образца (ФСБ-Т с 0.02% казеина, рН 9,5); ряды 2, 3, 5 и 6 – отмывочный раствор - ФСБ-Т (0.02 М натрий-фосфатный буферный раствор с 0.8% NaCl, 0.1% твин-20 и 0.1% азида натрия, рН 7.2); ряд 4 – рабочее разведение конъюгата в ФСБ-Т; ряды 7, 8, 10 и 12 – очищенная вода; ряд 11 стабилизатор окраски – 1% тиомочевины в 1% растворе NaOH на очищенной воде. В ячейки девятого ряда помещали таблетки (5 мг) сухого компонента физического проявителя (смесь метола и лимонной кислоты в соотношении 2:5).

В качестве конъюгата в дот-иммуноанализе использовали золь золота (20 нм), адсорбционно связанный с мышиными моноклональными антителами против IgG человека (Au-a/IgG-Hum). Изготовление конъюгатов на основе коллоидного золота выполняли по ранее описанной методике

Дот-иммуноанализ. Исследование проводили при комнатной температуре (23оС) в аналитических ваннах с объемом рабочих растворов в ячейках 0,3 мл. На подготовительном этапе анализа перфоратором производили вскрытие фольги над ячейками первого ряда и вносили по 15 мкл исследуемых препаратов крови. Для растворения сухого компонента физического проявителя в ячейки девятого ряда добавляли по 200 мкл очищенной воды из флакона 1. После этого аналитические матрицы погружали в первый ряд ячеек и инкубировали 25 мин. Далее матрицы инкубировались в следующих рядах ячеек в соответствии со схемой проведения анализа, описанной ранее

Рисунок 1 - Примеры результатов дот-анализа образцов и основные элементы экспериментального набора «SARS-CoV-2-спектр-IgG»: 

a – примеры результатов дот-анализа образцов пациентов: 1 и 2 –переболевших COVID-19; 3 и 4 – привитых вакциной «ЭпиВакКорона»; 5 и 6 – привитых вакциной «Спутник – V»; 7 и 8 – не имевших контакта с вирусом SARS-CoV-2; b – схема размещения реагентов захвата на подложке; c – основные элементы экспериментального набора «SARS-CoV-2-спектр-IgG»

DOI:10.60797/BMED.2025.4.1.1

Результаты параллельного исследования образцов с использованием экспериментального набора и тестов сравнения приведены в таблице 1. Положительные результаты анализа выделены в таблице жирным шрифтом. Приведенные в таблице 1 положительные образцы массива (№ 1-65) включают: панель сывороток крови, полученных от пациентов, привитых вакциной «ЭВК» (№ 1-35); панель проб, полученных от пациентов, привитых вакциной «Спутник V» (№ 36-52); а также панель образцов, полученных от пациентов, ранее перенесших клинически подтвержденную инфекцию вирусом SARS-CoV-2 (№ 53-65). Отрицательные образцы массива (№ 66-80) включают панель донорских сывороток крови и проб от пациентов с различной инфекционной патологией, отобранных в период до 2019 г.

Принцип обнаружения специфических антител в исследуемых образцах заключается в образовании комплексов между антителами из исследуемого образца и известными антигенами возбудителя (реагентами захвата), иммобилизованными на плотной подложке, с последующим выявлением этих комплексов с применением конъюгата – антителами против иммуноглобулинов человека (реагентами детекции), связанных с легко выявляемой меткой. При инфицировании вирусом SARS-COV-2 гуморальная иммунная система человека вырабатывает специфические нейтрализующие антитела против различных элементов вируса, обладающих антигенными свойствами

В тесте сравнения «SARS-CoV-2-ИФА-Вектор» использованы полноразмерные рекомбинантные антигены S и N вируса. Результаты, приведенные в табл. 1, показывают, что такое сочетание антигенов позволяет выявлять весь спектр положительных образцов, но формирует положительные сигналы с 6 (40%) отрицательными сыворотками.

Тест-система «SARS-CoV-2 IgG RBD-ИМБИАН-ИФА», основанная на использовании рекомбинантного фрагмента RBD антигена S, надежно выявляет образцы от пациентов, привитых вакциной «Спутник V» и переболевших COVID-19, но не реагирует с образцами в отрицательной части массива (что согласуется с мнением о высокой специфичности RBD антигена

В экспериментальном наборе «SARS-CoV-2-спектр-IgG» использованы рекомбинантные антигены RBD, N и белковый комплекс из состава вакцины «ЭВК», раздельно иммобилизованные на подложке из синтетической бумаги. Дополнительно на подложку нанесены: IgG из крови человека (контроль работоспособности конъюгата) и коллоидное золото (контроль работоспособности проявляющей системы). Свободная от компонентов зона подложки используется для контроля фоновых явлений. Данные таблице 1 показывают, что набор избирательно выявляет антитела ко всем использованным антигенам коронавируса, что позволяет дифференцировать случаи иммунитета, приобретенного в результате перенесенного заболевания (выявляются антитела ко всем антигенам), а также в ответ на введение вакцин «Спутник V» (выявляются только антитела к антигену RBD) и «ЭВК» (выявляются антитела к белку N и пептидам «ЭВК»). Случаи положительной реакции со всеми антигенами среди образцов от вакцинированных пациентов (образцы 3, 8, 12, 13, 23, 31 и 38), могут быть следствием ранее перенесенного в легкой или бессимптомной форме заболевания COVID-19. Определение RBD антител в дот-анализе хорошо согласуется с результатами ИФА в наборе ООО «ИМБИАН». В отличие от набора «SARS-CoV-2-ИФА-Вектор» набор производства ООО «ИМБИАН» и набор «SARS-CoV-2-спектр-IgG» не выявляют ложноположительных сигналов в отрицательной панели образцов, что позволяет предполагать происхождение таких сигналов при анализе набором для ИФА производства ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» за счет использования в нем полноразмерного S белка и согласуется с мнением о более высокой специфичности фрагмента RBD по сравнению с полноразмерным S антигеном

Таким образом, экспериментальный набор «SARS-CoV-2-спектр-IgG» позволяет одновременно избирательно определять антитела класса IgG к антигенам RBD и N вируса SARS-CoV-2, а также к пептидам из состава вакцины «ЭВК», что позволяет дифференцировать случаи иммунитета, приобретенного в результате перенесенного заболевания, а также в ответ на введение вакцин «Спутник V» или «ЭВК». Дот-анализ с использованием этого набора выполняется в течение 1 ч при комнатной температуре, не требует энергообеспечения и особой квалификации оператора и может быть реализован в амбулаторных условиях.